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Scientific Reports volume 12、記事番号: 13798 (2022) この記事を引用

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赤血球 (RBC) および血小板 (PLT) から白血球 (WBC) を体外で分離する白血球除去療法は、がんやその他の疾患を持つ患者の治療に使用される救命処置であり、また、製品製造の最初のステップとして使用されます。細胞および遺伝子に基づく治療。 白血球除去療法は成人には忍容性が高いですが、標準的な遠心分離ベースの装置の体外容量（ECV）がこれらの患者の総血液量の特に大きな割合を占めるため、新生児や低体重児には重大なリスクをもたらします。 ここでは、白血球除去療法を行うための遠心分離に代わる可能性がある制御増分ろ過 (CIF) 技術に基づいた新しいハイスループット マイクロ流体デバイス (ボイド ボリューム 0.4 mL) について説明します。 CIF デバイスは、複数のヘマトクリット (5 ～ 30%) および流量 (10 ～ 30 mL/分) で健康なボランティアからの全血を使用して広範囲にテストされました。 フロースルー方式では、CIF デバイスは、生理食塩水でヘマトクリット 10% に希釈した全血を流速 10 mL/min で処理しながら、85% 以上の効率で白血球を分離し、赤血球と血漿分画の損失は 10 ～ 15% でした。 再循環方式では、CIF デバイスは同様のレベルの分離性能を実証し、3.5 時間の模擬白血球除去手順の終了までに再循環血液中の白血球を実質的に枯渇させました (約 98% 減少)。 重要なのは、このデバイスは目詰まりや分離性能の低下なしに動作し、白血球と白血球の活性化は最小限に抑えられ、赤血球に対する測定可能な損傷はありませんでした。 遠心分離ベースの白血球除去療法の典型的なパラメータと比較して、CIF デバイスは、互換性のある流量で動作しながら、空隙容積が少なくとも 100 倍小さく、白血球の除去速度が約 2 倍、PLT の損失が約 2 ～ 3 倍少なくなりました。現在の慣例では。 CIF デバイスが動作するヘマトクリットと流量は、他のマイクロ流体細胞分離法について以前に発表されているものよりも大幅に高かった。 最後に、この研究は、マイクロ流体デバイスを使用して再循環血液から細胞を高効率で分離することを実証した最初の研究です。 全体として、これらの発見は、ハイスループットのマイクロ流体細胞分離技術を使用して、最終的に遠心分離不要の低ECV白血球除去療法を可能にする実現可能性を示唆しています。 このような機能は、現在十分な治療を受けられていない弱い立場の患者グループである幼い子供たちに特に役立つでしょう。

白血球除去療法は、患者の血液をアフェレーシス装置に通して白血球 (WBC) を収集し、赤血球 (RBC) と血小板 (PLT) を患者に戻す複雑な医療処置です 1,2。 白血球除去は、白血球除去と白血球収集という 2 つの潜在的な救命応用を可能にします。 白血球除去は、白血病患者の危険なほど高い白血球数を減らすために使用できます 3,4 、または炎症性腸疾患 5,6,7 およびその他の症状の薬物を使用しない治療法として活性化白血球を除去するために使用できます 8,9。 白血球除去による白血球の収集は、顆粒球注入 10,11、養子免疫療法 12,13,14,15、造血幹細胞移植 16,17,18、および新しい遺伝子ベースの治療 19,20 を含む、幅広い細胞療法 2 を製造するための最初のステップです。 。

一般に成人や年長の小児には忍容性が良好ですが、新生児や低体重児に対する白血球除去療法の実施は技術的に困難であり、臨床的に危険です。 現在、白血球除去療法は遠心分離ベースのアフェレーシス装置を使用して行われており、その体外容積 (ECV) は通常 150 ～ 250 mL の範囲 (患者に接続する追加のチューブを除く)2,21 であるのに対し、総血液量 (TBV) は体重 10 kg の乳児では、わずか約 750 mL です22,23。 ECV は TBV の大部分を占めるため、小児患者は、低血圧、症候性低カルシウム血症、アレルギー反応、カテーテル関連血栓症、感染症、重度の貧血、さらには死亡など、白血球除去処置に関連した重篤な合併症の発生率が大幅に高くなります21。 、24、25、26、27、28。 原理的には、通常の白血球除去フィルター 29,30 や、活性化顆粒球と単球を選択的に吸着する酢酸セルロースビーズを充填したカラムを使用して WBC を分離することもできます。 しかし、これらのデバイスの分離能力は物理的なサイズによって制限されており、デバイスに捕捉された白血球は炎症誘発性サイトカインを血流に放出し続け、バックフラッシュによる捕捉された白血球の回収はかなり控えめです6、29、30。

マイクロフルイディクスを使用して白血球除去を小型化する初期の試みでは、連続流拡散フィルターを利用して血液サンプルから高効率 (約 97%) で白血球を除去しましたが、顕著な RBC 損失 (約 50%) と流速わずか 5 でした。 μL/分31. それ以来、血球分離のためのマイクロ流体技術の使用は (白血球除去に特化したものではありませんが) 着実に増加しています 32。 「慣性集束」に基づくデバイス 33,34 は、比較的高い流量 (1 ～ 20 mL/min) で細胞分離を実行できますが、血液サンプルの大幅な希釈 (< 1% ヘマトクリット、HCT) を必要とします 35,36,37。 「決定的横方向変位」(DLD)38 に基づくデバイスは、必要な希釈が大幅に少なくなりますが、最小フィーチャ サイズが非常に小さく (< 5 µm)、妥当な流量 (< 7 mL/min) で動作させるには複数のポンプと非常に高い駆動圧力が必要です。 )、多くの場合、細胞は PLT およびフォン ヴィレブランド因子を活性化するのに十分な高いせん断応力にさらされます 39、40、41、42。 「制御増分ろ過」（CIF）は、実質的に大きな最小フィーチャ サイズ（約 20 μm）を持ち、デバイス全体の流体抵抗とせん断を低減することで、これらの制限を克服しました 43,44。 その結果、CIF ベースのデバイスは、最大 30 の流量で、単核球 (MNC) 濃縮物 (約 5% HCT) から 85% を超える WBC (RBC および PLT の損失は 30% 未満) を分離することができました。 mL/min46 および CIF を使用して濃縮および白血球除去された PLT は最小限の活性化でした 43,44。 これらの重要な進歩にもかかわらず、前述のデバイスはどれも再循環方式で長期間テストされておらず、血球やデバイスの性能に対するそのような処理の影響はほとんど知られていないままです。

この研究では、最小限に希釈された再循環全血から白血球をハイスループット分離するために設計された、空隙容積がわずか 0.4 mL の新しい CIF ベースのデバイスについて説明します。 まず、HCT (5 ～ 30%)、ろ過液:保持液の流量比 (2 ～ 13:1)、および流量 (10 ～ 30 mL) の複数の変数を個別に調整しながら、フロースルー方式でデバイスの分離性能をテストしました。 /分）。 このデバイスは、流速 10 mL/min で 10% HCT で希釈した全血を処理しながら、85% 以上の WBC 除去効率 (RBC および PLT の損失はわずか 10 ～ 15%) を実証しました。 再循環方式でテストした場合、デバイスは詰まりや分離性能の低下なしに動作し、3.5 時間の模擬白血球除去手順の全期間にわたって、白血球と白血球の活性化が最小限に抑えられ、赤血球への測定可能な損傷はありませんでした。 再循環血液中の白血球濃度は指数関数的に減少し、処置の終了までに約 98% 減少しました。

制御増分フィルタリング (CIF) の動作原理と、CIF ベースのデバイス設計の生成に使用される計算フレームワークについては、以前に詳細に説明しました 43、44。 典型的な CIF 設計は、一連の「錠剤」型ポストによって分離された 3 つの同一線上のフロー チャネルで構成され、中央チャネルとサイド チャネルを流体的に接続する濾過ギャップを定義します (図 1)。 血液サンプルが中央チャネルを通って流れると、その流れのごく一部が各濾過ギャップを通ってサイドチャネルに吸い上げられます。 サイドチャネルの幅は、濾液の流入に対応するために徐々に増加します。 この増加率は、前述したように計算され 43、各ギャップから抽出される流量の割合を正確に制御します。 濾液によってサイドチャネルに引き込まれるには大きすぎる細胞のサイズカットオフ（「臨界直径」）を決定するのは、ギャップの幅ではなく、この流れの割合の大きさです。 この研究で使用したCIF設計の臨界直径は6μmで、ほとんどの白血球を中央チャネルに保持しながら、赤血球とPLTが妨げられることなくサイドチャネルに流出できるようにしました（図1）。 各ギャップから抽出される流量部分は比較的小さいため、望ましい濾液：残留液の流量比を達成するには、CIF 設計に何千ものギャップを組み込む必要があります 43,44。 実際には、濾過ギャップの数 (したがって流量比) は、製造技術によって許容される最大チャネル長によって制限されます 44、46。

制御された増分ろ過 (CIF) による、赤血球および白血球からの白血球の分離。 ほとんどの WBC は大きすぎるため、濾液によってサイド チャネルに引き込まれることができないため、中央チャネルに保持されて濃縮されます。 RBC と PLT はデバイスの臨界直径よりも小さいため、デバイスの流量比に従って濾液と保持液の間に分配されます。

CIF デバイスは、並列に多重化された 48 個の個別の CIF 要素のアレイで構成されていました (図 2)。 各 CIF エレメントの全体の設置面積は 1.4 mm × 73 mm で、次のもので構成されていました (図 2a): (i) 血液サンプル中に存在する可能性のある微小凝集体およびその他の破片を保持するための内蔵フィルター、(ii) トランジション各サイドチャネルは、最小フィーチャーサイズを約 20 µm に維持しながら適切な流量画分が確実に抽出されるように、一連の徐々に短くなる蛇行セグメントで構成されている領域 44、および (iii) 線形分離領域 (長さ約 61 mm) では、幅がサイドチャネルの幅は徐々に増加し、中央チャネルの幅は全長にわたって減少しました。 デバイス層の一連の貫通穴により、すべての CIF 要素の共通の入口と出口への流体アクセスが可能になりました。 中央チャネルの出力は、別の最上層の大規模チャネルのネットワークを通じて収集されました (図 2b)。 完全に組み立てられた CIF デバイスには、血液サンプルがデバイスの各 CIF 要素に分配される入口が 1 つと、すべての CIF 要素の中央チャネル (保持液) と側チャネル (濾液) の出力を収集するための 2 つの出口がありました (図 1)。 2c)。 多重化 CIF デバイスの空隙容積は、チューブを除いて 0.4 mL でした (図 2c)。

CIFベースのマイクロ流体デバイス。 (a) CIF 要素の設計。 入口付近のサイドチャネルの幅 ws(in) = 21 μm、出口付近 ws(out) = 154 μm。 入口付近の中央チャネルの幅 wc(in) = 120 μm、出口付近 wc(out) = 70 μm。 ろ過ギャップ幅 g = 19 μm。 すべてのチャネルの深さは全体で 140 μm です。 (b) 多重化 CIF デバイスのコンポーネント: (i) デバイスの各 CIF 要素から中央チャネル出力 (残留物) を収集するためのより大きなチャネルのシステムを含む「トップ層」、(ii) からなる「デバイス層」並列に配置された個々の CIF 要素、および (iii) デバイスのチャネルをシールするための平らな基板。 (c) 10% HCT 血液サンプルが充填された 48 個の多重 CIF 要素で構成される、組み立てられたマイクロ流体デバイス。 スケールバーは1cmです。

まず、CIF デバイスのパフォーマンスに対するサンプル HCT の影響をテストしました。 WBC除去効率は、10％HCTを含むサンプルで最も高く（88.4±1.3％）、サンプルのHCTが増加するにつれて低下しました（図3a）。 20% HCT を含むサンプルの場合、CIF デバイスは、デバイスを通過する血液中に最初に存在する WBC の 57 ± 7% を除去することができました。 RBC および PLT の除去率（損失）は、HCT の増加に伴ってわずかに増加しました。HCT 5% での RBC の 10.6 ± 0.9%、PLT の 9.1 ± 0.5% から、30 での RBC の 14.8 ± 0.1%、PLT の 14.1 ± 0.5% まで増加しました。 % HCT (図 3a)。 デバイスの臨界直径より小さい細胞について予想されたように、RBC および PLT の損失パーセントは、デバイスの流量比、つまり 100/(1 + 流量比) に基づいて予測された値とほぼ一致しました (図 3a、破線)。

フロースルー領域における CIF デバイスの性能。 細胞除去の依存性 (a) サンプル HCT (流量 10 mL/min、n = 3)、(b) デバイス流量比 (10% HCT、流量 10 mL/min、n = 5)、(c)流量 (10% HCT、n = 3)。 パネル (a) と (c) では、流量比をそれぞれ 8.70 ± 0.39 と 8.21 ± 0.13 に設定し、実験のパラメーターに応じて変更させました。 各パネルでは、破線は、各実験で測定された流量比に基づいて計算されたデバイスの臨界直径より小さい細胞の予想除去パーセントを示します。 表示された値は平均値 ± 標準偏差です。

CIF デバイスは、デバイス出口の圧力が同じであると仮定して、特定の流量比を持つように設計されています。 流量比をリアルタイムで制御するために、保持液と濾液を収集するリザーバーの相対的な高さを変えることで出口間の圧力差を生み出しました。 次いで、装置が動作する実際の流量比は、濾液の体積を単位時間当たり装置から収集された保持液の体積で単純に割ることによって計算された。 この簡単な操作により、流量比を広範囲（約 6 倍、図 3b）で調整することができました。 流量比が低いほど WBC 除去率が高く、~9 までのすべての流量比で一貫して 80% 以上を維持しました (流量比 8.9 ± 1.5 では 84 ± 3% に達します)。 RBCとPLTの除去（損失）は、流量比に対する予想された相互依存性に従い（図3b、破線）、流量比1.9±0.1でRBCの37.5±0.8％、PLTの36.1±2.4％から急速に減少しました。流量比 8.9 ± 1.5 (予想損失 10%) では、RBC の場合は 10.9 ± 1.4%、PLT の場合は 11.4 ± 1.1% (予想損失は 34%)、さらに RBC の場合は 8.2 ± 0.9%、PLT の場合は 7.9 ± 1.4% に低下します。流量比 12.6 ± 2.1 の PLT の場合（予想損失 7%）（図 3b）。 RBC と PLT の損失がデバイスの流量比に大きく依存することを考慮すると、流量比をリアルタイムで調整できる機能は、白血球除去手順の重要なパラメーター (つまり、WBC の除去、RBC および PLT の損失) を装置の流量比に一致させるのに役立つ可能性があります。個々の患者の固有のニーズ。

さらに、流量 10 ～ 30 mL/min での CIF デバイスの分離効率を評価しました (図 3c)。 WBC 除去率は、流量の増加に伴い、10 mL/min での 88.0 ± 2.5% から 30 mL/min での 81.0 ± 1.4% まで徐々に減少しました。 デバイスの流量比も、10 mL/min での 8.21 ± 0.13 から 30 mL/min での 4.00 ± 0.03 まで低下しました (図 3c)。 この低下は、同様のデバイスで以前に観察されたように、より高い駆動圧力/流量での PDMS の弾性変形による CIF チャネル形状の歪み (膨らみ) によって引き起こされました 46。 その結果、RBC および PLT の損失は、傾向に従って、10 mL/min での RBC の 12.0 ± 1.1%、PLT の 13.1 ± 1.5% から、30 mL/min での RBC の 19.4 ± 0.6%、PLT の 18.0 ± 2.0% に増加しました。流量比に基づいて予想されます (図 3c、破線)。

次に、フロースルー実験でデバイスの性能を最大化する操作パラメータ (流量、流量比、サンプル HCT) を使用して、再循環方式で CIF デバイスをテストしました。 我々の再循環セットアップ (図 4a) では、179.7 ± 0.8 mL の希釈 WB (10% HCT) で満たされた血液バッグを使用して、被験者の TBV をエミュレートしました。 各再循環ラウンド中に、56.5 ± 0.8 mL の血液サンプルがバッグから (サンプリング ポートの 1 つを通ってバッグの底まで挿入されたチューブを介して) 採取され、次に CIF デバイスを通過しました。流量10mL/分。 保持液 (1 ラウンドあたり 5.6 ± 0.5 mL) を円錐管に収集し、CIF デバイスの上に上げて、8.8 ± 0.3 の望ましい流量比を生成しました (図 4a)。 再循環方式で動作する装置の流量比を計算するために、濾液の体積は、再循環ラウンドごとに装置を通過して押し出される体積と廃棄物リザーバーに収集される保持液の体積との差として推定されました。 濾液は、バッグの上部にあるもう一方のサンプリングポートを通ってバッグに戻され、血液の「入口」と「出口」がバッグの反対側に効果的に配置され、混合が促進されました。 さらに、バッグ内の細胞が均一に分布するように、各再循環中および再循環後に血液バッグを混合しました。 この「離脱 - 注入」サイクルを約 3.5 時間にわたって 12 回繰り返しました。 各ラウンドの完了後、測定のためにバッグと保持液から 0.2 mL のサンプルを採取しました (サンプリング バルブを介して)。 各再循環ラウンド後の血液バッグの容積の変化を追跡するために、抽出された保持液および各サンプルの容積を記録した。

再循環中の血液からの白血球の除去。 (a) 再循環実験に使用した実験装置。 血液バッグには、生理食塩水で 10% HCT に希釈した 179.7 ± 0.8 mL の WB を充填しました。 残留物（濃縮された白血球）を収集する廃棄物リザーバーは、デバイスの 55 cm 上に配置されました。 得られた装置流量比は 8.8 ± 0.3 でした。 各再循環ラウンドで、56.5 ± 0.8 mL のサンプルがバッグから抜き取られ、次に 10 mL/min の流速で CIF デバイスを通して注入され、同時に 5.6 ± 0.5 mL の残留物 (廃棄物) が生成されました。 1 mL シリンジを使用してバッグから血液を採取しました。 矢印は回路内の血液の流れの方向を示します。 (b) 再循環方式における CIF ベースの細胞分離の各ラウンド後の細胞濃度の変化。 示された値は平均 ± 標準偏差 (n = 9、6 人の固有の被験者からの血液を使用) です。 実線は体積 (y = − 0.0608x + 1.7975、R2 = 0.9997)、RBC (y = − 0.0044x + 1.1037、R2 = 0.8218)、および PLT (y = − 0.0059x + 0.6072、R2 = 0.8485) の線形当てはめです。 、および WBC に適合するモデル (二乗平均平方根誤差を最小限に抑えるために WBC が 81% 除去される)。

血液バッグ内の白血球の濃度は、再循環実験全体を通じて指数関数的に減少しました（図4b）。 3 回の再循環ラウンド (約 170 mL の処理量) 後、WBC 濃度は最初のサンプルの 1.59 ± 0.41 × 103/μL から 0.72 ± 0.26 × 103/μL まで 55% 減少しました。 ラウンド 6 (処理量約 340 mL) では、WBC 濃度はさらに 0.28 ± 0.15 × 103/μL (初期レベルから 82% 減少) まで減少しました。 再循環実験 (ラウンド 12、処理量約 680 mL) の終了までに、バッグ内の WBC は実質的に枯渇しました (初期レベルから約 98% 減少)。 RBCとPLTの濃度は、再循環実験の全期間にわたって直線的に減少しました（図4b）：RBCの場合は〜4.5％減少しました（1.09±0.03×106/μLから1.04±0.05×106/μL; y = − 0.0044） x + 1.1037、R2 = 0.8218)、PLT では ~ 14.5% (0.62 ± 0.07 × 105/μL から 0.53 ± 0.06 × 105/μL; y = − 0.0059x + 0.6072、R2 = 0.8485)。 CIF デバイスの臨界直径よりも小さい細胞は流量比に従って分布するため、その濃度は濾液と保持液の両方で同じである必要があります。 したがって、CIF デバイスを介した血液再循環が血球の特性に及ぼす影響を調査しました。

イメージングフローサイトメトリー（FC）を使用して、WBC（CD11b）とPLT（CD62P）の活性化、およびバッグから採取されたサンプルのPLT-WBC凝集体形成を測定しました（ラウンド0）前、ラウンド6中、直後（ラウンド 12) 再循環実験 (図 5)。 分離された WBC の活性化 (保持液出力) を実験中 (ラウンド 6) と実験後 (ラウンド 12) に測定しました。 さらに、5 回の再循環実験のうち 4 回では、被験者の血液サンプルが実験期間中ベンチトップ (BT) に保管され、単に室温で長期間保管されることによる WBC と PLT の活性化を制御しました。期間。 すべてのサンプルは、安静時（採取時）およびホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート（PMA; WBC の場合、図 5a、b）またはトロンビン受容体アゴニストペプチド-6（TRAP; PLT および PLT-WBC の場合）とインキュベートした後に検査されました。凝集体、図5c、d）は、CIFの再循環が、関連する刺激に応答して活性化するWBCおよびPLTの能力にどのような影響を与えるかを評価しました。

WBCおよびPLTの活性化状態に対する再循環体制におけるCIF処理の影響。 (a) 再循環血液中に残っている白血球 (CD11b) の活性化。 (b) 保持液 (廃棄物) とともに除去された WBC (CD11b) の活性化。 (c) 再循環 PLT (CD62P) の活性化。 (c) 再循環血液中の PLT-WBC 凝集体の形成。 測定は、再循環実験の前（ラウンド 0）、最中（ラウンド 6）、および後（ラウンド 12）に収集されたサンプルのフローサイトメトリーを介して、安静時および PMA（パネル a および b）または TRAP（パネル）による追加活性化後の両方で実行されました。 CD）。 BT (赤い記号) は、細胞活性化に対する時間のみの影響を評価するために、各再循環実験の期間中取っておかれた血液サンプルを表します。 統計的有意性は、p < 0.05 の場合 * で示されます。 各記号は異なる再循環実験を表します (n = 5、4 人の固有の被験者からの血液を使用)。

再循環血液中の白血球は徐々に活性化されますが、再循環実験の終了時（ラウンド 12 後）には、BT 対照ほど活性化されませんでした（図 5a）。 保持液で除去された白血球は、再循環血液中に残っている白血球とほぼ同じ活性化されており、ラウンド6とラウンド12で抽出された細胞の間に活性化に有意な差はありませんでした（図5b）。 再循環実験中のいつサンプリングされたかに関係なく、再循環白血球と除去白血球は両方とも、PMA（陽性対照）とのインキュベーション後に著しく活性化することができました。これは、細胞が処理後に不応性にならなかったことを示唆しています（図5a、b）。

PLT に対するせん断の潜在的な影響にもかかわらず、再循環血液中の PLT の活性化は、実験の全期間にわたって大幅には増加しませんでした。 CIFデバイスを介した再循環のラウンド12の後、PLT活性化のレベルはBT対照のレベルと同様でした（図5c）。 低い活性化はPLTの不応性によって引き起こされる可能性がありますが、再循環するPLTはTRAP（陽性対照）への曝露時に顕著に活性化することができたため、そうではありませんでした（図5c）。 せん断に対する PLT の高い感受性と、同様の CIF デバイスに関する以前に発表された調査結果 43,44,45 を考慮すると、再循環 PLT の活性化が少なくともある程度増加することが観察されると予想されました。 考えられる説明の 1 つは、活性化された PLT のほとんどが利用可能な WBC に即座に結合して PLT-WBC 凝集体を形成したということです。 実際、PLT-WBC 凝集体の数は、各再循環実験中に時間の経過とともに着実かつ大幅に増加しました (図 5d)。 PLT-WBC凝集体に参加しているPLTは、PLTの活性化と数を測定するときに除外されます。これは、再循環PLTの活性化が比較的低いままであり（図5c）、それらの濃度が時間の経過とともに徐々に低下していることを説明できます（図4b）。 全体として、12ラウンドの再循環後の再循環血液中のPLT-WBC凝集体の数はBT対照と同じであり（図5d）、この増加は処理時間による可能性が高く、CIFデバイスからの寄与があったことを示唆しています。比較的軽微です。 さらに、細胞活性化と PLT-WBC 凝集体形成を最小限に抑えるための 1 つの潜在的な解決策は、容積スループット (例えば、追加の多重化による) または分離効率 (例えば、追加の設計改良による) のいずれかを増加させることによって処理時間を短縮することであるということになります。デバイス。

最後に、各実験の前（ラウンド 0）、実験中（ラウンド 6）、および直後（ラウンド 12）の遊離ヘモグロビン（Hb）およびカリウムのレベルを測定することにより、CIF デバイスを介した再循環が赤血球に損傷を与えるかどうかをテストしました。 我々は以前、同じアッセイを使用して、洗浄中に保存された赤血球への遠心分離によって引き起こされる亜致死損傷を高感度に特定しました47,48。 CIF再循環手順全体を通じて、遊離Hbレベルの有意な変化は観察されず、すべてのサンプルでカリウムレベルは検出可能なレベル（< 0.2 mM）未満のままでした（表S1）。 溶血の兆候がなければ、再循環血液中で観察された RBC 濃度の低下 (図 4b) の最も可能性の高い説明は、過剰な数の RBC が保持液とともに除去されたことです。 実際、保持液（廃棄物）中の RBC 濃度は再循環血液よりも一貫して高く（図 4b）、平均して約 0.1 × 106/μL でした（表 S2）。 白血球除去サンプルを処理する際に保持液中に同様の RBC の蓄積が観察された以前の研究で説明したように 46、RBC は非常に変形しやすい両凹ディスク (直径約 8 μm、厚さわずか約 2 μm) であるため、有効直径は大きく異なる可能性があります。各濾過ギャップ付近の特定の条件に応じて異なります。 ほとんどの RBC は、濾液を追跡できるほど十分に小さい有効直径を持っていますが、一部の赤血球はそうでないため、中央チャネルに留まり、特徴的な蓄積を引き起こす傾向があります 46。

従来のアフェレーシス装置は遠心分離を利用して白血球を赤血球および血小板から分離するため、小児患者のニーズに合わせて白血球除去回路のＥＣＶを低減できる程度が制限されます。 この研究で説明されている CIF デバイスの空隙容積 (0.4 mL) は、典型的な遠心分離ベースのアフェレーシス装置 (150 ～ 250 mL) の空隙容積よりも少なくとも 100 倍小さかった 49。 この ECV の劇的な減少は、最終的に幼児に対する安全で効果的な白血球除去処置を可能にするマイクロ流体細胞分離の主な利点を表しています。 この研究は、以前の CIF 設計 46 に基づいて構築されており、これまでに検討したものよりもまったく新しい、はるかに困難なアプリケーションに取り組みます。 CIFマイクロ流体デバイスは、再循環方式で3時間以上動作しながら、分離性能の顕著な低下もなく、細胞特性への影響も最小限に抑えながら、80%以上の効率で希釈全血から白血球を分離できることが初めて実証されました。 さらに、現在のデバイスは、これまでのレポートに比べて、HCT が 2 倍高く、RBC および PLT 損失が 2 ～ 3 倍低く、最適に動作しました 46。

白血球除去または細胞採取のために白血球除去療法を受けている小児患者は通常貧血状態であり、平均 HCT は 20 ～ 30% です 49,50。 20% HCT では、CIF デバイスの WBC 除去効率は約 60% であり、一部の患者にとっては許容可能なレベルの性能である可能性があります。 現在の CIF デバイスのプロトタイプをそのピーク分離効率 (白血球除去 > 80%) で動作させるには、血液をデバイスに入る前に 10% HCT に希釈し、患者に戻す前に元の HCT に濃縮し直す必要があります。 このような血液濃縮は、過剰な体液を除去するために、小児の心肺バイパスおよび体外膜型酸素供給中に、優れた生体適合性と最小の空隙量を備えたデバイス（例、8 mL、Hemocor HPH Junior、Minntech Corp.、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、以下の流量で日常的に行われます。白血球除去療法（最高 100 mL/min）51． より高い HCT でのデバイスの分離性能の低下は、確率的細胞間相互作用の数の増加と、デバイスの設計時に使用したモデルからのチャネル内の血液の見かけの粘度の偏差によって説明できる可能性があり、どちらも次のようになります。 HCT46、52、53が増加するとより顕著になります。 より高い HCT で CIF 分離効率をさらに高めるには、これらの要因に対処するための追加の研究が必要となります。

私たちの研究で CIF デバイスがピーク分離性能で動作した流量 (10 mL/分) は、通常 10 ～ 50 mL/分で実行される臨床白血球除去手順と同様です 1,17,54。 より高い流量で観察された分離効率の低下は、同様のデバイスで以前に観察されたように、より高い駆動圧力でのデバイスチャネルの変形（膨らみ）によるものと考えられます46。 この影響は、この研究で使用した PDMS エラストマーではなく、最終的に硬質熱可塑性プラスチックから CIF デバイスを製造することで最小限に抑えることができます 39,40,55。

CIF デバイスが最適なパフォーマンスで動作する HCT (10%) と流量 (10 mL/分) は、最小限に希釈された全血から白血球を分離するように設計された他のマイクロ流体デバイスについて以前に報告されているものよりも大幅に高かった 39,40,42,56 、57、58、59、61。 重要なのは、この研究が、他のすべてのマイクロ流体細胞分離デバイ​​スで採用されているフロースルー方式とは対照的に、再循環方式で動作しながら血液から細胞を高効率で分離できるマイクロ流体デバイスを初めて実証したことです32。

この研究における再循環は、処置の全期間にわたって複数の「吸引-注入」サイクルを経るようプログラムされたシリンジポンプを使用して達成されました。 このような再循環へのアプローチは、大規模なECVまたは長時間の処置に通常使用される不連続モードのアフェレーシス装置の操作1,49、または遠心分離ベースの白血球除去療法が危険すぎると考えられる場合に幼児に対して時々行われる手動交換輸血によく似ています。患者の血行力学的状態、回路のECVと比較して比較的小さいTBV、および/または適切なサイズのカテーテルを配置する能力28、62。 注目すべきことに、CIF デバイスは、従来の白血球除去手順の一般的な持続時間である 3 時間以上にわたって分離効率を維持しながら、詰まりの兆候もなく血液を処理できました 1,17,54,62。 白血球除去を目的としたデバイスは長期間にわたって再循環血液を処理できなければならないため、この発見は特に重要です。

白血球減少の文脈では、従来の遠心分離ベースの白血球除去療法では、通常、1 ～ 2 TBV50 を処理する場合は約 3 分の 1、2 ～ 3 TBV63 を処理する場合は約 2 分の 1 に白血球濃度が減少します。 CIF デバイスは、再循環血液中の白血球濃度を約 2 倍の速度で低下させることができました。TBV を 1 つだけ処理した場合は 2 分の 1、TBV を 2 つ処理した場合は 5 分の 4 に減少しました。 臨床的観点から見ると、白血球除去処置中の RBC と PLT の損失を最小限に抑えることは、同種血液製剤の輸血に伴うリスクを軽減するために重要です。 CIF デバイス操作中の PLT の損失は、遠心分離ベースの手順で一般的なものよりも約 2 ～ 3 倍低かった（この手順では、両方の細胞タイプが「バフィーコート」に共局在するため、PLT は白血球と同じ速度で除去される） '層)50,63。 RBC と PLT の損失をさらに減らすために CIF デバイスの流量比を高めるには、追加の研究が必要です。

遠心分離中に高いせん断力にさらされると、細胞膜に機械的損傷が生じ、過剰な細胞活性化が誘発され、止血反応が誘発される可能性があり、新生児や乳児における白血球除去療法に関連する多くの有害な転帰の一因となる可能性があります21、24、28、64。 私たちの実験では、再循環血液中の WBC と PLT は BT 対照 (手順の間ベンチに残されたサンプル) の細胞ほど活性化されず、CIF デバイスによる追加の活性化が最小限であることを示唆しています。 さらに、WBC と PLT は両方とも、適切な刺激剤への曝露後に活性化することができ、これは細胞が CIF 処理後に抵抗性ではないことを示唆しています。 最後に、赤血球への損傷の証拠も見つかりませんでした。 総合すると、私たちのデータは、閉ループ再循環方式で動作する CIF デバイスが血球を著しく活性化したり損傷したりしなかったことを強く示唆しています。

遠心分離は、再循環血液から必要な効率と体積スループットで白血球を分離できる唯一の技術であるため、白血球除去療法の実行に使用されます。 この研究は、ハイスループットのマイクロ流体細胞分離技術を使用して、最終的に遠心分離不要の低ECV白血球除去療法を可能にする実現可能性を実証しています。 このような機能は、現在十分な治療を受けられていない弱い立場の患者グループである幼い子供たちに特に役立つでしょう。

すべての実験は、被験者の保護のためにヒューストン大学と米国保健福祉省によって確立されたガイドラインと規制に従って行われました。 ヒトの血液サンプルを含むすべての実験プロトコルは、ヒューストン大学治験審査委員会 (ヒト被験者保護委員会 1、プロトコル #16272-01) によって承認されました。 すべての被験者および/またはその法的保護者からインフォームドコンセントを得た。 全血 (WB) の単位はガルフ コースト地域血液センター (テキサス州ヒューストン) から購入しました。 新鮮なＷＢのサンプルは、健康なボランティアから静脈穿刺によって得た（抗凝固剤：酸性クエン酸デキストロース、溶液Ａ；Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）。 サンプルはすぐに使用するか、使用するまで血液銀行冷蔵庫 (4 °C、iB111、Helmer Scientific、インディアナ州ノーブルズビル) に保管し、等張食塩水 (0.9% w/v NaCl、RICCA Chemical Company、テキサス州アーリントン) で希釈しました。目的のヘマトクリット (HCT) を達成します。

制御増分ろ過 (CIF) 技術に基づくデバイスの設計と製造については、以前に詳細に説明されています 43、44、45、46。 一般的な CIF 設計では、すべての濾過ギャップの幅は約 20 μm に固定されています。これは、「最小フィーチャ サイズ」が 20 μm 未満のマイクロ流体デバイスは、現在利用可能な製造方法を使用して大量生産することが非常に困難であるためです。 同様に、アスペクト比 (深さ:幅) が約 7:1 を超えるマイクロ流体デバイスの製造可能性は非常に限られています。 したがって、CIF デバイスは、設計の基本的な製造可能性を維持しながら、流体抵抗をできる限り低くする (したがって、所定の駆動圧力での流量/スループットが高くなる) ように、チャネル深さが約 140 µm になるように設計されています。 ギャップの幅が固定されているとすると、以前に詳細に説明したように、各ギャップで中央チャネルからサイドチャネルに通過する流れの割合は、チャネルの幅の変化によって制御されます44。 この濾過流量割合がゼロの場合、流体はギャップを通って流れないため、流体によってサイドチャネルに細胞が運ばれることはありません。 濾過流量の割合が増加すると、各ギャップを流れる流体の量が増加するため、流れによってサイドチャネルに引き込まれるのに十分なほど小さいセルのサイズも増加します。 ギャップを通って流れる流体によって引っ張られるには大きすぎる細胞は、中央チャネルに残ります。 したがって、ギャップを通る流体の流れの大きさによって、分離サイズのカットオフが決まります（一定に保たれるギャップ幅ではありません）。 ギャップ幅からサイズカットオフを切り離すことで、以前に実証したように、20 µm ギャップを持つ CIF デバイスでギャップよりも小さい粒子/細胞をうまく分離できるようになります 43、44、45、46。

MATLAB (マサチューセッツ州ナティックの MathWorks Inc) のカスタム コードを使用して生成された CIF デバイス設計は、厚さ約 140 μm のフォトレジスト層 (SU-8 3050; カヤク アドバンスト マテリアルズ社、マサチューセッツ州ウェストボロー) に転写されました。ソフト リソグラフィーを使用した 4 インチのシリコン ウェーハ (University Wafer、マサチューセッツ州サウスボストン)。 マスター ウェーハはポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS; Sylgard 184、Dow Corning Corp、Midland、MI）で複製され、PDMS レプリカ（デバイス層）は酸素プラズマを使用して PDMS でコーティングされたペトリ皿（平らな基板）に対してシールされました（ PDC-001、ハリック・プラズマ、ニューヨーク州イサカ）。 デバイス層の入口ポートと出口ポートは、チューブ接続に適合する適切なサイズの生検パンチ (Acuderm Inc、フロリダ州フォートローダーデール) を使用して作成されました (内径 1.02 mm および 0.58 mm、Scientific Commodities、アリゾナ州ハヴァス市)。 多重化デバイスの個々の CIF 要素からの濾液と残留液の出力を収集するための大きなチャネルのシステムを含む追加の PDMS 層がデバイス層の上部に結合されました。 結合後、組み立てられた各 CIF デバイスを 1% (w/v) の mPEG シラン (分子量 5000、Laysan Bio Inc、アラブ、アラバマ州) 水溶液で 70 °C で 25 分間処理しました。 最後に、デバイスを GASP バッファー (9 mM Na2HPO4、1.3 mM NaH2PO4、140 mM NaCl、5.5 mM グルコース、1% w/v ウシ血清アルブミン、290 mmol/kg、pH 7.4) でフラッシュし、保存するまで 4 °C で保存しました。使用。

再循環セットアップは、適切なサイズのルアーロック コネクターを介してリンクされたプラスチック チューブ (Scientific Commodities) によって多重化 CIF デバイスおよび回路の他のコンポーネントに接続された血液バッグ (500 mL; Fenwal 4R1590、GenesisBPS、ニュージャージー州ラムジー) で構成されました。 （ニューヨーク州ロンコンコマのコシナ）。 血液サンプルを血液バッグの底部から CIF デバイスに運ぶチューブをシリンジ ポンプ (Genie Touch、Kent Scientific、コネチカット州トリントン) に接続し、2 つの三方活栓 (Qosina) を介して CIF デバイスの入口に接続しました。 。 1 つの活栓はバッグからの血液をサンプリングするために使用され、もう 1 つの活栓はシリンジ ポンプをバッグの出口 (バッグから血液を引き出すため) またはデバイスの入口 (血液を注入するため) に接続するために使用されました。デバイス）。 ポンプの動作モード (注入/排出) と活栓の位置は、実験中に手動で設定されました。 血液バッグは、各再循環中および再循環後に手で混合されました。

血液分析装置 (XS-1000i、Sysmex America, Inc.、イリノイ州ムンデライン) を使用して、5 部差分による全血球数を測定しました。 WBC、RBC、および PLT 数を使用して、次のように各細胞タイプの除去率を計算しました: \(\%除去={C}_{r}/\left({C}_{r}+{C}_{ f}\times FR\right)\times 100\)、\({C}_{r}\) は保持液内の細胞数 (すべての CIF 要素の中央チャネル出力)、\({C}_{ f}\) は濾液中の細胞数 (すべての CIF エレメントのサイドチャネル出力)、\(FR\) はデバイスの流量比 (濾液出力の累積体積と濾液出力の累積体積の比として定義されます) です。装置の保持液出力）46． すべての流量比は、測定された体積に基づいて計算されました。

イメージング フローサイトメトリー (FC、Amnis ImagestreamX Mk II、Luminex Corporation、テキサス州オースティン) を使用して、以下の抗体カクテル (すべて BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ）。 PLT 活性化: CD41a/APC (20 μL; BD 559,777)、CD62P/PE (20 μL; BD 555,524)、カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS-/-; 10 μL)。 トロンビン受容体アゴニストペプチド 6 (TRAP; 70 μM; Sigma) を PLT 活性化のポジティブコントロールとして使用しました。 WBC 活性化: CD45/APC (5 μL; BD 561,864)、CD62L/FITC (20 μL; BD 555,543)、CD11b/PE (20 μL; BD 555,388)、および DPBS-/- (25 μL)。 ホルボールミリスチン酸酢酸塩 (PMA; 0.5 μg/mL; Sigma) を WBC 活性化のポジティブコントロールとして使用しました。 PLT-WBC 凝集体 (PLA): CD45/APC (5 μL)、CD41a/FITC (20 μL; BD 555,466)、および DPBS-/- (45 μL)。 TRAP (70 μM) を PLA 形成のポジティブコントロールとして使用しました。 FC 測定を行うために、30 μL の血液サンプルを各抗体カクテルに加え、穏やかに混合し、暗所で室温 (RT) で 15 分間インキュベートしました。 抗体標識後、1X BD FACS 溶解溶液を使用して RT で 15 分間 RBC を溶解しました。 溶解後、サンプルを 900 × g で 5 分間遠心分離して上清を除去し、ペレット化した細胞を 1% パラホルムアルデヒド 100 μL に再懸濁し、FC 測定を行うまで (24 時間以内) 4℃ で保存しました。

上清中の遊離ヘモグロビン（Hb）のレベルは、製造業者の指示に従って改良シアンメトヘモグロビン法を使用して測定した（ドラブキン試薬; D5941、Sigma）。 簡単に説明すると、血液サンプルを 1000 × g で 5 分間遠心分離して RBC をペレットにし、上清 40 μL をドラブキン試薬 160 μL に加え、20 分間インキュベートしました。 プレートリーダー（SpectraMax M5、Molecular Devices、Sunnyvale、CA）を使用して、540 nmで吸光度を測定しました。 Ｈｂ濃度は、ヒトＨｂ標準物質（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ、Ｃａｎｔｏｎ ＭＩ）を用いて構築された検量線を使用して計算された。 カリウム（K+）レベルは、前述したように、CHEM8 + カートリッジを使用した手持ち式血液分析装置（i-STAT、Abbott Laboratories、イリノイ州アボットパーク）を使用して測定しました47。

すべての値は平均±標準偏差として表されました。 観察された差異の統計的有意性 (p < 0.05 として定義) は、細胞数データについては対応のある両側 t 検定、Hb 測定については一元配置分散分析、および二元配置反復測定分散分析または混合効果を使用して決定されました。モデル (制限された最尤法) は、FC 測定に対する Sidak の多重比較テストと時間と活性化状態の両方について一致しました。

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この出版物で報告された研究は、ヒューストン大学の高優先領域研究シード助成金 (I0503554、PI: SSS) および国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所から、賞番号 R01HL151858 (PI) によって一部支援されました。 ：SSS）。 内容は著者のみの責任であり、必ずしも国立衛生研究所、米国退役軍人省、または米国政府の公式見解を表すものではありません。

ヒューストン大学生物医工学部、3605 Cullen Blvd、ヒューストン、テキサス州、77204-5060、米国

ダリア・L・レザール、ラビン・ウエルタ、アントン・ムハメドシン、マデリン・ルー、セルゲイ・S・シェフコプリャス

小児救命救急医学部門、ベイラー医科大学、ヒューストン、テキサス州、77030、米国

フォン・W・ラム

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DLL、FWL、および SSS が研究を設計し、データを分析しました。 FWLとSSSは資金を獲得し、プロジェクトを監督した。 DLL と ML はマイクロ流体デバイスを製造しました。 DLL、FWL、RH、および ML が実験を実行しました。 AM はデータ分析と解釈を支援しました。 DLL、FWL、SSS が原稿を書きました。 著者全員が原稿を批判的にレビューし、承認しました。

セルゲイ・S・シェフコプリャスへの通信。

SSS は、制御された増分濾過技術を記載した米国特許第 9,789,235 号「粒子の分離と濃縮」の発明者であり、その商業化により恩恵を受ける企業である Halcyon Biomedical Incorporated の共同所有者です。 他のすべての著者は利益相反を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

DL・レザール、FW・ラム、R・ウエルタ 他制御された増分ろ過に基づいたハイスループットのマイクロ流体デバイスで、遠心分離不要の体外体積の少ない白血球除去療法を可能にします。 Sci Rep 12、13798 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-16748-5

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受信日: 2022 年 3 月 2 日

受理日: 2022 年 7 月 14 日

公開日: 2022 年 8 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16748-5

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