CDCボトルバイオアッセイ、WHOチューブテスト、およびネッタイシマカを使用した局所適用バイオアッセイによって生成された死亡率データのばらつきの比較

寄生虫とベクター 15 巻、記事番号: 476 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

殺虫剤耐性は依然として大きな公衆衛生問題です。抵抗性の監視は、効果的な媒介生物制御および抵抗性管理の計画に不可欠です。蚊に対して一般的に使用される殺虫剤感受性バイオアッセイは、CDC ボトルバイオアッセイと WHO チューブテストです。現場ではあまり一般的ではありませんが、新規殺虫剤の開発における殺虫剤感受性を評価するためのゴールドスタンダードと考えられているのは、局所適用バイオアッセイです。これらのバイオアッセイのそれぞれには、殺虫剤感受性を評価する方法に重大な違いがあり、耐性集団と感受性集団を区別したり、さまざまなレベルの耐性強度を決定したりする能力に影響を与えます。

DM耐性ネッタイシマカMC1株を用いたデルタメトリン（DM）に対する用量反応を確立する際に、CDCボトルバイオアッセイ、WHOチューブテスト、および局所適用バイオアッセイを比較しました。用量反応曲線を確立し、モデル予測の変動を評価するために、蚊をさまざまな濃度の殺虫剤に曝露しました。さらに、死亡率の変動の程度を評価するために、20～25 匹の蚊を 10 回繰り返し、中間の死亡率で固定用量に曝露しました。

局所適用バイオアッセイは用量反応データの変動量が最も少なく、次に WHO チューブテストが続きました。 CDC ボトルバイオアッセイの変動レベルは最も高かった。固定用量実験では、WHO チューブ試験や局所適用バイオアッセイと比較して、CDC ボトルバイオアッセイで同様に高い分散が見つかりました。

これらのデータは、耐性集団と感受性集団を区別し、経時的および集団間の変化を評価するのに、CDC ボトルバイオアッセイの検出力が最も低く、局所塗布バイオアッセイの検出力が最も高いことを示唆しています。この観察は、さまざまなアッセイからの監視結果の解釈に重要な意味を持ちます。最終的には、監視の目的、現場での実用性、その目的を達成するためのツールの精度の観点から、最適な殺虫剤耐性監視ツールについて議論することが重要になります。

殺虫剤耐性は継続的な進化の問題です。霧吹きや殺虫蚊帳などのベクター制御介入が失敗したため、ジカ熱、デング熱、チクングニア熱、マラリアなどの蚊が媒介する病気の永続の一因となっています[1、2、3、4]。ベクター媒介性疾患を効果的に制御するには、新旧の殺虫剤の殺虫剤耐性を徹底的に監視し、耐性管理戦略を改善することが不可欠です[2、5、6]。監視データは、特定の地域における抵抗力プロファイルを特定するために使用されます。これは、抵抗力がいつどこで発生または拡大しているかを特定し、抵抗力防止戦略を知らせるのに役立ちます。耐性を早期に検出すると、殺虫剤の使用クラスを変更できます。耐性を過小評価したり過大評価したりしないことが重要であるため、これらの設定では正確なデータ収集が不可欠です。過小評価すると、効果のない化学物質の継続使用による媒介生物制御の低下、効果のない製品の適用による資源（お金と時間）の浪費、および蚊の集団内でより高いレベルの耐性を選択する可能性が生じる可能性があります。このような偽陰性の観察は、90 または 97% 未満の死亡率を正確に検出するにはアッセイの感度が不十分であること、使用したサンプルサイズが小さいこと (ランダムな変動により偽の結果が生じる)、アッセイの準備の不正確さ (蚊がより多くの殺虫剤を吸収すること) によって発生する可能性があります。意図したものよりも）、乱暴な取り扱い（蚊は殺虫剤にさらされるのではなく、乱暴な取り扱いによって死にます）、または不正確な死亡率評価。一方で、過大評価は効果的な殺虫剤が不必要に新しい殺虫剤に置き換えられる可能性があり、これらの代替殺虫剤がより高価であり、したがって処理できる世帯の範囲が狭まる場合には特に問題となる可能性がある。このような偽陽性は、90 または 97% 未満の死亡率を正確に検出するアッセイの感度の欠如、サンプルサイズが小さすぎる、アッセイの準備の不正確さ (蚊の曝露量が少なすぎる)、および評価の不正確によって同様に発生する可能性があります。死亡率（たとえば、不安定な飛行をする蚊を生きていると識別しますが、それは「死んだ」の定義に従います[5、7]）。したがって、バイオアッセイの準備を標準化し、死亡率の評価を可能な限り客観的に保ち、最高レベルの精度を持つアッセイを選択することが重要です[8]。十分な蚊の数を得ることが多くの地域で問題となるため、耐性集団と感受性集団を確実に分類するために必要な蚊の数を減らすため、変動レベルが低いバイオアッセイが望ましいと考えられます。ただし、各バイオアッセイが生成する固有の変動のレベルは完全には確立されていません。

成虫マラリアベクターの日常的な監視のための最も一般的なバイオアッセイは閾値アッセイであり、診断濃度の殺虫剤（通常、感受性のある蚊の 99% を殺す致死濃度の 2 倍）に曝露した後にベクターサンプルの表現型反応が測定されます。死亡率が 90 ～ 97% の場合、集団は「耐性が疑われる」と定義され、耐性を確認するためにアッセイを繰り返す必要があります。死亡率が 90% を下回る場合、その集団は耐性が確認されたと定義されます [5]。最初の閾値アッセイに続いて、強度アッセイを実行して、より高い用量（通常は診断濃度の 5 倍および 10 倍）での生存を判定し、耐性強度が低いか、中程度か、または高いかを判定することができます [5]。このような異なるレベルの耐性強度は、長期持続性殺虫ネット (LLIN) などのベクター制御ツールが複数回の曝露後に効果を発揮する程度と関連しています [9]。ただし、一般に、これらのアッセイは、集団の技術的耐性を確立すること、つまり集団の表現型反応が時間的または空間的に変化したかどうかを評価することを目的として設計されています。現場でのベクター制御ツールの有効性に関するこのようなアッセイの予測値は限られています [5、10]。最も一般的に使用される 2 つの閾値バイオアッセイは、世界保健機関 (WHO) のチューブテスト [5] と疾病管理予防センター (CDC) のボトルバイオアッセイ [7] です。どちらも、足根の接触を介して蚊を殺虫剤に曝露します。蚊は処理された表面に着陸します）。 WHOのチューブテストでは、殺虫剤とキャリアオイルを塗った紙で裏打ちされたプラスチックチューブの中に蚊を入れます。 CDC ボトルのバイオアッセイでは、殺虫剤を塗布したガラス瓶に蚊を吸引します。最近、化学的特性により濾紙への含浸を妨げるピリプロキシフェンなどの有効成分を試験するために、WHO ボトルバイオアッセイが CDC ボトルバイオアッセイの改良版として導入されました [5、11]。閾値アッセイのほかに、局所適用バイオアッセイなど、感受性株に対する耐性比の計算を可能にする用量反応曲線を確立するバイオアッセイもあります。蚊には、一定範囲の殺虫剤用量が個別に投与されます [12、13、14]。局所適用バイオアッセイは毒性研究のゴールドスタンダードと考えられており、殺虫剤の毒性を判定し交差耐性を評価するために第 I 相研究で WHO によって推奨されています [15]。局所適用バイオアッセイは、殺虫剤耐性監視ツールとして時折使用され (例 [16,17,18,19])、最近では経口摂取殺虫剤の新しい監視ツールとして推奨されました [14]。マラリア流行地域でマラリア媒介動物の耐性を監視する。

さまざまなバイオアッセイがどのように機能するか、また何を測定するかには重要な違いがあります。まず、殺虫剤の接触方法が異なり、CDC ボトルや WHO チューブの試験では足根接触による蚊の暴露が行われ、局所塗布試験では表皮への直接塗布が行われます。 CDC ボトルバイオアッセイでの曝露時間は 30 分ですが、WHO チューブテストでは 1 時間であり、局所適用バイオアッセイでは直接適用するため曝露は瞬時に行われます。 WHO のチューブテストでは、殺虫剤をキャリアオイルと混合し、紙に含浸させます。これらの論文の作成は一元化されており、Universiti Sains Malaysia から論文を注文できます。 CDC ボトルバイオアッセイおよび局所アッセイで蚊が曝露される濃度は通常、各研究施設によって調製されますが、CDC ボトルバイオアッセイ用に事前に調製された濃度は CDC に無料で要求できます [20]。 WHO チューブテストでは、シリンダーチューブの両端に未処理の休憩場所を設け、蚊が一定期間またはテスト期間全体にわたって殺虫剤にさらされないようにすることができます。 CDC ボトルバイオアッセイにおける死亡率評価は 30 分の曝露時間の終了時に行われますが、WHO チューブテストと局所塗布では曝露後 24 時間後に行われます。蚊の取り扱いも異なり、局所塗布では蚊は CO2 または氷で倒され、ピンセットとブラシを使用して扱われますが、他の 2 つのアッセイでは蚊はもっぱら手動吸引によって移されます。最後に、局所適用アッセイでは、各蚊コホートの平均体重を制御することで蚊 1 ミリグラムあたりの用量を評価しますが、CDC ボトルや WHO チューブ試験では体重は制御されません (図 1)。アッセイ間のこれらの違いは、蚊集団の殺虫剤感受性の決定における違いにつながる可能性があります。

CDC ボトルバイオアッセイ (左の列)、WHO チューブテスト (中列)、および局所適用バイオアッセイ (右の列) の違いの概要。詳細についてはメソッドのセクションを参照してください

最も広く使用されている 2 つのバイオアッセイ、CDC ボトルバイオアッセイと WHO チューブテストを比較するためにいくつかの研究が実施されていますが、これらは非常に矛盾しています。一部の研究では、特に中程度の耐性集団を比較した場合に、一致度が低く[21,22,23]、一致度が高い場合[23,24,25]、中間レベル[23,26,27,28,29]が報告されています。蚊に対する局所適用バイオアッセイと他の既存のバイオアッセイを比較した研究はほとんどありません。ネッタイシマカとヒトスジシマカに関するフランスのある研究では、用量反応曲線を確立するために局所塗布とWHOチューブテストの両方を使用し、かなり類似した耐性比値が得られたが、蚊は非常に感受性が高いため、耐性比値が低かったことに注意すべきである。したがって、潜在的な差異を検出するのは困難です[30]。しかし、米国フロリダ州での別の研究では、CDC ボトルバイオアッセイでは検出されなかった野外の蚊の殺虫剤感受性の違いを局所適用バイオアッセイで検出できることがわかりました [18]。マレーシアでの同様の研究では、WHO チューブが試験では野外株を耐性として特定できなかったが、局所適用アッセイでは両方とも耐性として特定された[17]。上記のすべての研究において、特に中等度の耐性集団で差異が観察されました。これは、平均死亡率が 100% を下回り、0% を超える場合にのみ変動が観察されるため、これは論理的です。しかし、憂慮すべきことに、私たちが早期かつ正確に特定することを目指すべきなのは、中等度の耐性を持つ集団であるということです。

野外個体群の定量的用量反応アッセイは、閾値アッセイよりも蚊個体群の殺虫剤感受性状態に関するより正確な情報を提供します [18、23、29、31]。実際、CDC ボトルバイオアッセイ [7、32] および WHO チューブテスト [5] の強度アッセイは現在推奨されており、より広く使用されていますが、テストされる用量の制限は用量反応分析の実行には適していません [33]。用量反応分析にはより多くの蚊が必要であり、データのばらつきに応じて、統計的検出力を得るためにより多くの反復が必要になります。現在のフィールドバイオアッセイでは蚊の数がすでに制限になっているため、これはこの種のデータを収集する際の主なハードルの 1 つです。 CDC ボトルバイオアッセイでは高レベルの変動が観察されており、WHO のチューブテストでもある程度観察されています [22、29]。局所バイオアッセイで蚊が受ける線量は高度に制御されているため、局所適用アッセイの死亡率の偏差はより低いと予想されます。ここでは、Ae を使用した CDC ボトルバイオアッセイ、WHO チューブテスト、および局所適用バイオアッセイを並べて比較します。ピレスロイドに耐性のあるネッタイシマカ株。私たちの主な目的は、同じ研究者が実施した制御された実験室条件下で、同一の近交系蚊を用いて用量反応曲線を確立した場合のアッセイ内のばらつきを比較することでした。

4 ～ 6 つの異なるデルタメトリン (DM) 濃度の 4 回の反復を実行して、3 つの異なるバイオアッセイ (CDC ボトルバイオアッセイ、WHO チューブテスト、および局所塗布バイオアッセイ) の用量反応曲線を作成しました。これらの濃度は、死亡率が 0 ～ 100% の範囲となる予備的な範囲測定バイオアッセイを実行することによって選択されました。すべてのバイオアッセイは、午前 8 時 30 分から午後 4 時 30 分の間、周囲条件 (21 ± 2 °C、相対湿度 23 ± 3% [RH]) で実行されました。すべてのバイオアッセイにおいて、蚊は直立姿勢を保てない場合、または調整された動きで飛ぶことができない場合、「死んだ」とみなされました。すべての CDC ボトル、WHO チューブ、および局所用プラスチックカップには、盲目的死亡率評価用にランダムな ID がラベル付けされ、同じ研究者によって実施されました。日ごとの偏りを避けるために、個別の用量の反復を異なる日に実施しました。

殺虫剤アッセイ間の差異をさらに評価するために、曝露された蚊の 50% を殺す致死濃度/用量 (LC50 または LD50) に近い 1 回の固定用量で 10 回の反復を実施しました。予備実験で死亡率が 0% または 100% の反復実験が明らかになった場合は、平均値付近の変動の全範囲を評価できるように、それぞれより高い用量またはより低い用量を使用しました。これらのアッセイは、各アッセイについて 2 回の別々の実験で完了しました。したがって、典型的な WHO チューブテストおよび CDC ボトルバイオアッセイと同様に、同じ日に同じグループの蚊を用いて同じ用量で 5 回の反復が行われました。

エー。この研究ではネッタイシマカ MC1 (Maricopa County) 株を使用しました。このピレスロイド耐性株の卵は、2018年に米国アリゾナ州マリコパ郡のフェニックス地区で採取され、それ以来昆虫館で飼育され続けている。 MC1 はホモ接合耐性株であり、kdr 遺伝子に 2 つの既知の点変異、V1016I および F1534C (未発表データ) を持っています。 V1016I 変異は、ペルメトリンとデルタメトリンの両方の殺虫剤に対する耐性を与えます [34]。 F1534C 変異は、有機塩化物に加えて、ペルメトリンや他の I 型ピレスロイドに対する耐性を付与します [19、34、35、36]。しかし、別の kdr 変異と組み合わせない限り、II 型ピレスロイドに対する耐性は付与されないと考えられます [36]。蚊は、アリゾナ州立大学 (米国) の節足動物封じ込めレベル 1 (ACL-1) 昆虫施設で、27 °C、相対湿度 80%、光周期 12 時 12 時間に設定された孵卵器内で標準的な飼育条件下で飼育されました [12] 。テストされたすべての蚊は、生後 2 ～ 5 日の雌で、吸血されていませんでした。

デルタメトリン (Pestanal®、Sigma-Aldrich) 溶液は、重量法 (アセトンの体積ではなく殺虫剤の質量とアセトンの質量を使用) を使用して調製されました [12]。溶液は、（蒸発を減らすため）パラフィルムで蓋を巻いた15mlファルコンチューブ内で調製した。チューブをアルミホイルで覆い（紫外線暴露を防ぐため）、再密封可能なビニール袋に入れ（蒸発を減らすため）、さらに蒸発を防ぐために-20℃で保管しました。溶液は使用するまで少なくとも 1 時間室温で放置しておきました。

CDC ボトルバイオアッセイガイドライン [7] に記載されている一般的な手順に従いました。用量反応曲線を作成するために、5 つの Wheaton® 250 ml ガラスボトルを異なる濃度の DM で個別にコーティングし、対照として 1 つのボトルをアセトンのみでコーティングしました。ボトルをコーティングするために、1 ml の殺虫剤溶液 (またはアセトン) をピペットでボトルに加えました。殺虫剤がボトルとキャップのすべての部分を覆うように、ボトルに蓋をして操作しました。次いで、ボトルの蓋を外し、ボトル回転装置（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ（登録商標））上に１５分間置き、殺虫剤がボトルを均一にコーティングし、アセトンを蒸発させた。ボトルはアッセイで使用するまで、キャップをせずに暗所で最短 1 時間、最長 23 時間保管しました。約 25 匹 (95% CI: 22.7 ～ 28.3) の蚊をボトル内に吸引し、蚊をボトル内で 30 分間曝露した後、ノックダウン (脚で立つことも協調飛行することもできない、つまり「死亡」) させました。が評価されました[37]。

手順は、WHO のチューブテストで成虫の蚊の殺虫剤感受性をテストするための標準操作手順に記載されているとおりに行われました [5]。殺虫剤処理紙を準備するために、濾紙 (Whatman™ No. 1) を 12 × 15 cm の寸法に切りました。デルタメトリン濃度は、殺虫剤をアセトンおよびオリーブ油 (MP Biomedicals、Fisher Scientific) と混合することによって調製されました。粘度が低く、より正確な濃度が得られるため、シリコンオイルの代わりにオリーブオイルを使用しました。ＤＭ溶液を個々の紙の上に格子状に一滴ずつピペットで滴下した。対照紙はアセトンとオリーブオイルのみで処理しました。紙を換気フード内で 24 時間乾燥させた後、個別にアルミホイルに包み、4 °C の冷蔵庫に保管しました。使用の準備ができたら、各紙を WHO チューブ検査キット (Universiti Sains Malaysia のベクター制御研究ユニットから購入) の個別のプラスチック暴露チューブに入れました。未処理の濾紙（同じ寸法に切断）を個々の保持チューブに入れた。約 25 匹の蚊が保持チューブに吸引されました。 1時間後、ほとんどの蚊が曝露チューブに入るまで約1分間、トントンと短い息を吹きかけて蚊をなだめ、保持チューブから殺虫紙を敷いた曝露チューブに移動させた（曝露された平均数は24.0匹、95匹であった）。 % CI: 18.9 ～ 29.2)。 1 時間の曝露後、ノックダウンが記録され、蚊を空の保持チューブに戻しました。これらに 10% スクロース溶液を与え、27 °C、相対湿度 80% のインキュベーター内に置きました。 24時間後に死亡率を記録した。 WHO のガイドラインに従って、論文は最大 6 回使用されました。

蚊をケージからファルコンチューブに吸引し、すぐに蓋をして氷上に置きました。蚊は、投与前に少なくとも 30 分間氷上に放置されました。蚊を十分にたたき落とした後、氷を満たしたアイスボックス内のトレイに蚊を注ぎ、鉗子で拾い上げ、氷上の小さなプラスチックカップに置きました。各カップには 25 匹の蚊が含まれていました。微量天秤を使用して各カップの蚊の重さを０．１ｇ単位まで秤量し、その後、精密ガラス注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ（商標）８０４６５、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して蚊に０．５μｌの対照溶液または殺虫剤溶液を投与した。投与後、蚊をそれぞれのプラスチックカップに戻し、10％スクロース溶液を加え、27℃、相対湿度80％のインキュベーター内に置いた。死亡率は 24 時間後に評価されました。

アボットの補正は、同じ期間に実行された各テストの対照ボトル内の死亡率を使用して自然死亡率を制御するために適用されました [38]。対照群の死亡率が 20% を超えた場合、すべての同時検査は破棄され、繰り返されました。 3 つのアッセイすべてを統計プログラム R v4.1.3 で一般的に使用されている両方の方法と比較するために、2 つの異なる用量反応分析が実行されました [39]。まず、利用可能な BioRssay パッケージ [40] と同様に、BioRssay スクリプトに従ってプロビット分析が実行されました。このため、アボットの補正死亡率をプロビット値に変換し、過剰分散の可能性を考慮して、対数変換した濃度 (または用量) 値を準二項族で使用して一般化線形モデル (GLM) をフィッティングしました。近似の McFadden の R 二乗値は、1 − 対数尤度モデル/対数尤度ヌルとして計算されました。 CDC ボトルバイオアッセイおよび WHO チューブテストの LC50、および局所適用バイオアッセイの LD50 は、モデルの標準誤差に基づいて、対応する 95% CI を使用して計算されました。次に、nplr パッケージを使用して n パラメーターロジスティック回帰が実行され、重み付き適合度推定量に基づいて最適なパラメーター数を持つモデルが選択されました [41]。 LC50 および LD50 とその 95% CI は、最適モデルの標準誤差に基づいて推定されました。固定用量実験では、分散の均一性は Levene 検定を使用して評価され、その後、多重比較のボンフェローニ補正を使用して一対比較が行われました。

CDC ボトルバイオアッセイのネッタイシマカの診断用量 (10 mg/ボトル) に曝露された場合の MC1 株の死亡率は 69.0% で、診断用量の WHO チューブ検査 (0.03%) での死亡率は 0% でした (のみを使用して確立) 25 匹の蚊の 1 つの複製)、どちらもこの株が DM に対して耐性であることを示しています。 CDCボトルバイオアッセイの未処理対照ボトルの死亡率は、すべての用量反応実験（対照ボトル6本中6本）で0％、WHOチューブテストの1つ（対照ボトル7本中1本）で4％、そして8％でした。局所バイオアッセイでは 4% が 2 回、0% が 2 回でした。

n パラメーターロジスティック回帰では、5 パラメーターモデルが 3 つのアッセイすべてに対して最も高い適合度を示しました。局所適用バイオアッセイの適合度が最も高く (0.88)、次に WHO チューブテスト (0.55) が続き、最も低かったのは CDC ボトルバイオアッセイ (0.31) でした (図 2)。 5 パラメーターロジスティック回帰モデルを使用した CDC ボトルバイオアッセイの LC50 は 6.81 μg/ボトル (信頼できる 95% CI は推定できません)、WHO チューブ検査の LC50 は 0.76% (95% CI: 0.35 ～ 1.66) でした。局所適用バイオアッセイの LD50 は 0.36 ng/mg 蚊 (95% CI: 0.23 ～ 0.59) でした。

デルタメトリン耐性Aeの用量反応データ。 CDC ボトルバイオアッセイ (A)、WHO チューブテスト (B)、および局所塗布バイオアッセイ (C) でデルタメトリンに曝露されたネッタイシマカのメスの蚊。殺虫剤の用量はlog10スケールで表示され、死亡率は通常のスケールで表示されます。傾向線は、関連する 95% 信頼帯を伴う 5 パラメーターロジスティック回帰に基づいています。

3 つのアッセイすべてにおいて、殺虫剤の濃度または用量は、プロビット分析における死亡率と有意に相関していました (CDC ボトルバイオアッセイ、WHO チューブテスト、および局所バイオアッセイについて、それぞれ P = 0.038、P < 0.001、P < 0.001、図 3)。用量反応曲線の分散は、局所バイオアッセイで最も低く、McFadden R 二乗値 0.76 で、次に WHO チューブ検査 (R2McFadden = 0.44)、CDC ボトルバイオアッセイで最も高かった (R2McFadden = 0.17)。）。 CDC ボトルバイオアッセイの LC50 計算は 6.97 μg/ボトル (95% CI: 4.0 ～ 12.1)、WHO チューブ検査の LC50 は 0.74% (95% CI: 0.56 ～ 0.99)、局所バイオアッセイの LD50 でした。は 0.39 ng/mg (95% CI: 0.31 ～ 0.49) でした。

デルタメトリン耐性Aeの用量反応データ。 CDC ボトルバイオアッセイ (A)、WHO チューブテスト (B)、および局所塗布バイオアッセイ (C) でデルタメトリンに曝露されたネッタイシマカのメスの蚊。殺虫剤の投与量はlog10スケールで表示され、死亡率はプロビットスケールで表示されます。傾向線は、プロビットリンク関数を使用した一般的な線形モデリングに基づいており、McFadden の R 二乗値が各フィットに与えられます。

1 つの固定用量でのアッセイの変動を評価するために、CDC ボトルバイオアッセイでは 3.89 μg/ボトル、WHO チューブテストでは紙あたり 1% のデルタメトリン、および平均 0.30 ng デルタメトリン/mg 蚊 (95%) に 10 回の反復実験を行いました。 CI: 0.29 ～ 0.31、変動は反復ごとの平均蚊重量に応じて異なります)。平均死亡率は、CDC ボトルバイオアッセイで 35.9%、WHO チューブテストで 79.7%、局所適用バイオアッセイで 35.5% でした。各アッセイの 10 回の反復実験すべてで、死亡率は 100% 未満、0% より高かった。したがって、分散分析を確実に実行できます (追加ファイル 1、2、3)。異なるアッセイ間で分散レベルの非常に有意な差が観察されました (Levene 検定、F(2,27) = 6.3、P = 0.006、図 4)。ペアワイズ比較では、CDC ボトルアッセイの方が WHO チューブテストよりも有意に高い分散 (P = 0.007; Padj = 0.020)、局所バイオアッセイよりも CDC ボトルアッセイの方がより高い分散を示しましたが、この後者の比較は次の結果では有意ではありませんでした。ボンフェローニ補正 (P = 0.043; Padj = 0.13)。 WHO チューブ検査と局所適用バイオアッセイの間に分散の差は観察されませんでした (P = 0.18; Padj = 0.54)。

CDC ボトルバイオアッセイ (3.89 ng/ボトル)、WHO チューブテスト (1.0%)、および局所適用バイオアッセイ (平均 0.30 ng/mg 蚊) の単回用量での変動評価。丸と三角は 2 つの異なる日に収集されたデータを示します

この研究の目的は、CDC ボトルバイオアッセイ、WHO チューブテスト、および局所適用バイオアッセイからの死亡率データの変動を比較することでした。最も大きな変動は、CDC ボトルバイオアッセイによって生成された用量反応曲線内に見られ、次に WHO チューブテスト、そして最後に局所適用バイオアッセイで生成されました (図 2、3)。単一用量を 1 日に複数回繰り返してテストした場合、より少ない変動が観察され、日ごとの変動がさらに重要な役割を果たしていることが実証されました。しかし、1 日に複数の反復を行ったとしても、WHO チューブ検査や局所適用バイオアッセイと比較して、CDC ボトルバイオアッセイ内での死亡率にはかなり大きなばらつきが見られました (図 4)。観察された死亡率のランダム変動レベルが増加すると、蚊個体群の感受性状態を決定する際に誤りが発生する可能性が高くなり、その結果、ベクター制御の決定に影響を与えるだけでなく、感受性状態が時間の経過とともに変化しているのか、それとも蚊の感受性状態が時間の経過とともに変化しているのかを確立する能力が低下するでしょう。場所。このような比較を実行するための十分な統計的検出力を確保するために、CDC ボトルバイオアッセイでは、WHO チューブテストや局所適用バイオアッセイよりも多くの反復ボトルが必要になる場合があります。現在、CDC ボトルバイオアッセイでは、1 回の投与あたり 20 ～ 25 匹の蚊を 4 回反復する形で 80 ～ 100 匹の蚊を推奨しており [7]、WHO のチューブ検査では、1 回投与あたり 25 匹の蚊を 4 回反復する形で 100 匹の蚊に曝露することを推奨している [5]。ただし、これらの数字の根拠は示されていません。局所適用バイオアッセイに関する正式なガイドラインは存在しませんが、用量反応曲線を確立するために使用される場合、強度アッセイが実行されない限り複数回の用量をテストする必要があるため、使用される蚊の総数は CDC ボトルバイオアッセイまたは WHO チューブテストのいずれよりも多くなります。、2倍から3倍の数の蚊が必要です。診断用量での耐性を決定するために局所適用バイオアッセイが使用される場合 [14]、ショウジョウバエスズキイのバイオアッセイでこれが行われた方法と同様に、曝露される蚊の最適数を正式に確立する必要があります [8]。

観察された変動の違いを説明できるアッセイ間には、さまざまな違いがあります。まず、WHO チューブ試験と CDC ボトルバイオアッセイでは、蚊が吸う殺虫剤の量は、1 回の反復内および反復間ですべての蚊に対して同じではない可能性があります。ボトル回転装置を使用して乾燥プロセス中にボトルを回転させることに注意を払ったとしても、ボトル内の殺虫剤のコーティングは均一ではない可能性があります。ボトルのキャップ、首、底の濃度は高かったり低かったりする可能性があり、これは蚊が着地する場所に応じて異なる線量を摂取する可能性があることを意味します。さらに、殺虫剤がガラスに結合する能力は不明であり、特に実験開始時に死亡率を評価する際にボトルを撹拌したり叩いたりした場合に、さらに不均一な濃度が生じる可能性がある。私たちが知る限り、蚊のバイオアッセイや他の昆虫の同様のアッセイにおいて、ボトルの殺虫剤コーティングの均一性について研究が行われたことはありません。濾紙上への殺虫剤の塗布は、平らな表面上で行われるため、より均一になると思われるが、手動で油滴を散布する方法のため、依然として殺虫剤散布の不均一性の影響を受けやすい。ただし、アッセイ中、蚊はチューブの両端の未処理の表面に留まる可能性があるため、チューブ自体は不均一な環境になります。足根接触アッセイの問題は、特に吸収性表面上での殺虫剤の結晶化である [42]。これらの結晶は、その分布と形態に応じて、毒性の増加または減少を引き起こす可能性があります [43、44]。ガラス表面では結晶化は少ないと予想されますが、そのプロセスは無計画であり、DDT 配合物については予測が難しいと報告されています [43、45]。結晶化は、昆虫の歩行、表面の引っかき傷、ほこりなどの機械的刺激によって促進される可能性がある[42]が、実験開始時の死亡率評価中にボトルを回転させたり叩いたりする動きも同様に結晶化を引き起こすかどうかは不明である。結晶化は、ろ紙などの吸収性表面に殺虫剤を塗布する場合に特に懸念されるため、結晶化を抑えるためにキャリアオイルが使用されます。しかし、キャリアオイル自体が蚊に対する殺虫剤の利用可能性と吸収に影響を与えることも知られています[42、46]。したがって、紙に使用される殺虫剤の用量は、同じ死亡率に対して CDC ボトルバイオアッセイまたは局所バイオアッセイで使用される量よりも何倍も高くなります。観察された変動を説明できる可能性のあるこれらのバイオアッセイ間の 2 番目の違いは、死亡時点の違いとそれに伴う死亡数カウントの偏りです。 CDC ボトルバイオアッセイでは 30 分での死亡率を評価しますが、WHO チューブテストと局所塗布バイオアッセイでは 24 時間での死亡率を評価します。一方で、30分後のノックダウン表現型（死亡率の定義に従う）は曝露後24時間の実際の死亡率につながらない可能性があり、またその逆もあり得るため、これにより異なる表現型が評価されることになる。この表現型は、耐性の遺伝的経路の複雑さ、および他の遺伝的および環境的要因に応じて、本質的により多様である可能性があります。さらに、非常に多様な表現型が死亡率の定義に適合する可能性があるため、死亡率の評価にはかなりの程度の主観性が伴いますが、かなりの灰色の領域があります。第三に、CDC ボトルのバイオアッセイと WHO のチューブ検査で観察された変動は、蚊の体重の管理が不足していることが原因である可能性があります。これらの環境制御された近交系実験系統では体重の差はわずかであったが、野外個体群では、特に異なる季節や生態学的生息地からの個体群を比較した場合、その変動はより顕著になることが予想される[47,48,49]。これらのアッセイ間の最後の重要な違いは、蚊の取り扱いのレベルです。 CDC ボトルバイオアッセイおよび WHO チューブテストでは手動吸引器を使用した最小限の取り扱いが行われますが、局所適用アッセイではピンセットを使用して選別および投与する前に蚊は氷上で麻酔されました。この取り扱い方法では、特に一部の蚊のグループが他のグループよりも氷の上でより多くの時間を過ごす可能性が高いため、ある程度の変動が生じることが予想されますが、局所適用アッセイで観察された変動は、比較した 3 つのアッセイの中で最も低かったです。注目すべきはAeです。ネッタイシマカは寒さにさらされると特に適応性が高い[50]。このような取り扱い方法がハマダラカに異なる影響を与えるかどうかは不明ですが、CO2 は局所適用バイオアッセイで節足動物を麻酔するために使用できます [12、14]。

各バイオアッセイの精度以外にも、それぞれの状況で最適な監視ツールを選択するために重要なパラメーターがあります。まず、バイオアッセイのコスト、これらのアッセイを遠隔地で実行する現実性、およびスタッフの訓練の必要性があります。全体として、3 つのアッセイはすべて低コストで、持ち運びが可能で、実験室施設へのアクセスができない場所でも大規模なトレーニングなしで実行できます。さらに、最も適切な監視ツールは、研究の目的と研究地域に存在する抵抗力の種類によって主に決まります。 CDC ボトルのバイオアッセイで 30 分間のノックダウンを測定すると、殺虫剤の解毒により蚊が後で回復する可能性があるため、代謝抵抗性が高い場合には死亡率が過大評価される可能性があります [23]。研究の目的が技術的耐性を確立すること、つまり、標準化された条件下で集団の耐性表現型を測定し、それが経時的または異なる集団間でどのように変化するかを比較することである場合 [10]、3 つのアッセイはすべて適切です。データは、局所適用アッセイが、特に時間の経過や異なる現場間で蚊の体重が大きく異なる場合に、最高の精度を提供できる可能性があることを示唆しています。研究の目的が、殺虫剤耐性に直面してもベクター制御ツールが依然として有効であるかどうかを確立することである場合、現場に関連した環境下での現場に関連した蚊のプールの殺虫剤への自然曝露を模倣した実用的な耐性アッセイを開発する必要がある。条件。これらのバイオアッセイはどれもこの目的にはあまり適していません (これに関する議論については [5, 10] を参照)。

現在の作業にはいくつかの制限があります。まず、これらの結果は単一の蚊の種と系統、および単一の殺虫剤に基づいています。これらの発見の一般化可能性を評価するには、さらなる研究を行う必要があります。具体的には、ここでの作業ではAeを使用しました。ネッタイシマカはモデル種として使用されていますが、ハマダラカに対しては CDC ボトルバイオアッセイや WHO チューブテストも頻繁に行われています。ただし、ここで示した変動レベルがハマダラカの蚊では異なると仮定する理由はほとんどありません。異なる殺虫剤は異なる化学構造を有しており、異なる物質との結合に影響を及ぼし、さまざまなアッセイにおける殺虫剤の利用可能性に影響を与えます。これがアッセイにおけるランダムな変動に影響を与えるかどうかを評価する必要があります。次に、私たちの研究、特に CDC ボトルバイオアッセイにおいて、高レベルの変動が見つかりました。多くの研究では個々の反復実験の結果が報告されていないため、この変動が標準から外れているかどうかを評価するのは困難です。ただし、これらのデータを含むいくつかの研究では、ボトルバイオアッセイの用量反応データに高レベルの変動も観察されています[31、51]が、そのような高レベルの変動が常に見られるわけではありません[52]。私たちの研究における用量反応実験では、個々の用量の反復が異なる日に実施され、盲目的に評価されたため、蚊の溜まり、環境、およびボトルのコーティングの日々の状態の自然な変動が捕捉されました。さらに、30 分の曝露後の死亡率の評価は非常に主観的になる可能性があるため、異なる線量を盲目的に評価すると、死亡率の評価にこの主観が含まれることになります。対照的に、1 日の 1 回の線量評価は盲目的に行うことはできず、変動が小さい方向に偏る可能性が高くなります。実際、単回投与による 2 回目の実験では、より低い変動が観察されました。これは、日ごとの変動がなくなったか、死亡率評価における無意識の偏見が減少したか、あるいはその両方が原因である可能性があります。これらの実験で測定した変動は、研究室間の変動、研究者の変動、蚊の遺伝的背景の変動、および環境の変動がさらに存在するであろう現場で起こることの過小評価であると予想されます。殺虫剤に対する表現型反応に影響を与える[10]。実際、さまざまな研究施設にわたる用量反応データを編集すると、ばらつきが大きくなりました[29、53]。最後に、[54] 蚊は、取り扱い中および暴露中、温度と湿度の両方の点で以下よりも低い、制御された室温条件 (21 ± 2 °C、23 ± 3% RH) にさらされたことに注意することが重要です。これらの蚊にとって最適な条件 (27 °C、相対湿度 80% で飼育および曝露後保持)。これらの条件は蚊と殺虫剤に対する感受性に影響を与える可能性がありますが[10]、異なるアッセイ間で観察された分散の違いを説明できる可能性は低いです。

私たちのデータは、局所バイオアッセイが生成する変動量が最も少なく、したがっておそらく技術的耐性を確立するのに最も正確であることを示しています。対照的に、以前に見られたように、CDC ボトルバイオアッセイでは高レベルのランダム変動が生じ、そのため時間的または空間的に集団を比較する際の感度が低くなりました [18]。特に CDC ボトルバイオアッセイは現場で頻繁に使用されており、新しい殺虫剤の登場や耐性の強さを判定するためにその使用が増加する可能性があるため、これらの発見は非常に重要です。私たちの結果は、特に少量のサンプルが使用された場合、そのようなアッセイから得られるデータの解釈には注意が必要であることを示唆しています [8]。 CDC ボトルバイオアッセイと WHO チューブ検査はいずれも、高耐性集団を診断するための簡単かつ大雑把な方法として効果的かもしれないが、特に低レベルの耐性レベルの評価と比較には、おそらく局所適用バイオアッセイの方が現在の強度試験よりも適しているだろう。そして中等度の抵抗力を持つ人々。

この記事の結論を裏付けるデータセットは、追加ファイル 1、2、および 3 として含まれています。

95% 信頼区間

疾病管理予防センター

デルタメトリン

暴露された蚊の50％を殺す致死濃度

暴露された蚊の50％を殺す致死量

マリコパ郡から分離されたネッタイシマカ株

相対湿度

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エー。ネッタイシマカ MC1 株は、アリゾナ大学の Michael Riehle 博士のご厚意により提供していただきました。有益な議論をしていただいた Robin Harris 博士、James Collins 博士、Krijn Paaijmans 博士 (アリゾナ州立大学) に感謝します。また、MC1 蚊のコロニーの飼育を支援してくれた Sarah Rydberg に感謝します。 ASU Vislab は、図 1 の設計で認められています。

この研究は米国科学財団の支援を受けました (賞番号 2047572 および 2052363)。

アリゾナ州立大学生命科学部進化医学センター（米国アリゾナ州テンピ）

レイチェル・A・アルソフ & シルビー・ホイベン

計算科学およびモデリング科学センター、サイモン A. レビン数学、アリゾナ州立大学、米国アリゾナ州テンペ

シルビア・ホイベン

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RAA は実験を設計し、実行しました。 SHが原案・監修を担当。 RAA と SH は両方ともデータ分析を実行し、原稿を共同執筆しました。両著者は最終原稿を読んで承認しました。

Silvie Huijben への通信。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

CDC ボトルバイオアッセイデータ。

WHO のチューブ検査データ。

局所応用バイオアッセイデータ。

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転載と許可

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受信日: 2022 年 9 月 9 日

受理日: 2022 年 11 月 8 日

公開日: 2022 年 12 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-022-05583-2

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