ゲノムから - 佛山鉱業研究所グループ有限公司

Communications Biology volume 6、記事番号: 277 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

SARS-CoV-2 に対する予防的アプローチの武器を拡大すること、特にスパイクの抗原ドリフトに耐性のある戦略を拡大することが最も重要です。今回我々は、超強力な siRNA を同定するための超並列アッセイを使用して、SARS-CoV-2 ゲノムに対する 16,000 を超える RNAi トリガーのスクリーニングを実施しました。我々は、in vitro 検証のために 10 個の候補を選択し、生ウイルス実験において非常に強力な活性 (IC50 < 20 pM) と感染力の強力な遮断を示す 5 つの siRNA を発見しました。我々は、siRNA 候補の組み合わせによってこの活性をさらに強化し、複数の種類の懸念される変異体 (VOC) に対して活性なカクテルを同定しました。次に、飽和突然変異誘発を使用して、siRNA 標的部位における 2,000 を超える突然変異の可能性を調べ、将来の変異体に対する主要なカクテルの広範な保護を確認しました。最後に、我々は、ゴールドスタンダードのシリアンハムスターモデルにおいて、この siRNA カクテルの鼻腔内投与が疾患の臨床徴候とウイルス測定値を効果的に軽減することを実証しました。私たちの結果は、ワクチンやモノクローナル抗体とは異なる抗ウイルス予防の追加層の開発への道を開きます。

新型コロナウイルス感染症（Covid-19）は、現代において世界最悪のパンデミックの一つとなっている。ワクチンは大きな成果を上げてきましたが、ワクチンの欠点の一部に対処するために予防策の武器を拡充することが緊急に必要です1。まず、事実上すべての認可されたワクチンはスパイクタンパク質 2,3 をターゲットにしており、エスケープ変異体や新たな毒性変異体にさらされることを考慮すると、単一障害点に収束しています 4,5,6,7,8。さらに、すべてのモノクローナル抗体 (mAb) 治療はこれと同じタンパク質を標的とするため、このような抗原の変化はワクチンの防御を妨げるだけでなく、他の幅広い種類の治療の有効性を低下させる可能性もあります。第二に、重篤な疾患に対するワクチンの防御力は、通常、2 回目 9、3 回目 10、11、または 4 回目の接種後、わずか数か月以内に弱まることが複数の研究で示されています。第三に、マウスおよび非ヒト霊長類（NHP）に由来する最近の一連の証拠は、ウイルスに最初に曝露された場合、その後の曝露の結果を左右するため、ワクチンの更新版は有効性が低下し、元の抗原罪の影響を受ける可能性があることを示唆しています13,14。抗原的に関連した株に。これらのデータは、懸念される新たな変異種（VoC）に対するワクチン更新の有用性が限られていることを示唆しています。第四に、パクスロビッドなどの抗ウイルス薬は成人を新型コロナウイルス感染症への曝露から守るには不十分でした。最後に、いくつかの研究は、たとえ繰り返し投与した後であっても、免疫力が低下した個人において高い防御を達成することは困難であることを一貫して示しており 15 、これはワクチンを最も必要とする個人がワクチンの恩恵を受ける可能性が最も低いことを示唆しています。最後に、免疫不全患者の感染は長期間続く可能性があり 16,17 、これにより超進化と VoC の出現のリスクが増大し、公衆衛生に大きなリスクをもたらします。

低分子干渉 RNA (siRNA) が抗ウイルス薬として効果的に使用された複数の以前の研究の成功を裏付けとして、我々は、鼻腔内 (in) 投与された siRNA がウイルス感染症に対するワクチン増強手段として特に適していると想像しました。上気道で感染を軽減するために使用できます。

この目的を達成するために、非常に強力な候補を特定するために、SARS-CoV-2 ゲノムを標的とする 16,000 を超える RNA 干渉 (RNAi) トリガーをスクリーニングしました。このスクリーニングは、合成生物学システムを利用してウイルスに対する各 siRNA 候補のサイレンシング活性を再現する超並列アッセイである Sens.AI に依存しました。私たちの以前の研究 22,23 では、HIV および HCV に対して非常に強力な siRNA を同定するために Sens.AI の初期バージョンを使用しました。しかし、以前の設計は非効率的で、実施に 6 か月以上かかりました。新しい設計では、面倒な実験手順の代わりに統計学習を採用することで、信号対雑音比を向上させる、より迅速な方法を発明しました。広範なコンピューター解析とインビトロ実験により、2 つの非常に強力な siRNA 候補のカクテルが得られ、試験されたすべてのウイルス株に対して有効であることが証明されました。ついに。このsiRNAカクテルの鼻腔内投与は、SARS-CoV-2のシリアンハムスターモデルにおいて有効であることが確認された。

私たちは、SARS-CoV-2 ゲノムを解析して、一連の潜在的な短ヘアピン RNA (shRNA) ターゲットにしました (補足図 1)。このプロセスは、ゲノムを重複する 50 ヌクレオチド長の配列でタイリングすることによって実行され、それぞれの配列は互いに 1 ヌクレオチドずつシフトしました。各 shRNA が標的とする領域は、50 ヌクレオチド配列の中央に位置する 22 ヌクレオチドのストレッチで構成され、残りの隣接配列はゲノムのコンテキストを保存する役割を果たしました。次に、複数のインシリコフィルターを適用して、合成忠実度が低い標的領域、ウイルス株全体での保存の最小閾値を通過しない標的領域、一般的に劣悪なshRNA応答に関連する配列属性を含む標的領域、および潜在的に低品質のshRNA応答に関連するシード領域を有する標的領域を除外しました。人間の転写物と一致します (補足表 1)。このプロセスにより、SARS-CoV-2 ゲノムとそのサブゲノム RNA1 マイナス鎖を標的とする合計 16,471 個の shRNA 候補が取得されました。最後に、このライブラリーには、マウスゲノム内の癌関連遺伝子に対する以前のスクリーニングで報告されていた 1,118 個のポジティブおよびネガティブコントロール shRNA のセットが追加されました 22。

DNA オリゴプール (Twist Bioscience) を使用して、これら 17,589 個の shRNA とそれらに対応する 50 ヌクレオチドの標的領域を合成しました。これらのオリゴはそれぞれ 185 ヌクレオチド長で、2 つの PCR アニーリングサイト、miR-30 ベースの shRNA、設計によるガイドとそのパッセンジャー鎖、クローニングサイトを含むスペーサー、および標的部位を再現する 50 ヌクレオチド領域で構成されていました。そのゲノムコンテキストと併せて説明します (図 1a)。一連のクローニングステップを使用して、Venusレポーター遺伝子をスペーサー領域に導入し、Venusの3'UTRに50ヌクレオチドの標的領域が含まれるようにし、この構築物全体をレトロベクターライブラリーに挿入しました（図1b）。

オリゴデザイン。各オリゴは、ウイルス RNAi 標的部位に隣接する 50 ヌクレオチドストレッチとともに、miR-30 バックボーンに関連する独自の RNAi トリガーを持っていました。 b ライブラリの設計。各プラスミドには、Venus レポーターの 3'UTR の一部として、特定の RNAi トリガーとそれに一致するシスの標的部位が含まれていました。 c – e ヒト細胞における in vitro スクリーニングのスキーム： c RNAi 機構は最初にオフにされました。 Dicer-/- 293FT 細胞をプラスミドライブラリーに感染させ、T0 読み取り値を形成する Venushigh 発現について選別しました。 d 次に、RNAi 装置の電源を入れました。私たちは、不安定化した Dicer (ddDicer) の異所性発現によって RNAi 機構を回復しました。 e RNAi 機構の活性は定量的に調節されました。 2つの生物学的複製を、抗Dicer siRNAによる処理によってDicer発現を下方に、またはShield-1による処理によって上方に力価測定するように設計された7つの異なる条件に供した。 FACS ソーティングにより、Venuslow 細胞と Venusdark 細胞が収集され、それらのオリゴ構築領域の配列が決定されました。 f 結果として得られる画面のデータ行列。各行は、治療条件 (一番左の列) と FACS ゲート (暗いことを表す D、および低いことを表す L) の特定の組み合わせを表します。これらの行ベクトルは、ネガティブ (緑色の強調表示) およびポジティブ (赤色の強調表示) コントロールと比較した、テストされた各 RNAi トリガー (青色) の濃縮を示します。曲線下面積 (AUC) 列は、陽性対照と陰性対照を区別する能力に基づいて計算されました。 g 2 つの最良の条件の選択。最も高い AUC を持つ 2 行のベクターが選択されました。固有制御について計算された精度-再現率 (左) および受信機動作特性 (右) 曲線が示されています。各 RNAi トリガーのスクリーンスコアは、これら 2 行のベクトルの平均として計算されました。

我々のスクリーニング手順は、レトロベクター統合によって導入される可能性のある位置変動の影響を軽減するための 2 つのステップで構成されていました。まず、CAS9/CRISPRノックアウトによって操作されたヒトDicernull/null 293FT細胞株でスクリーニングを実施しました（図1c、補足図2a、b）。 Dicer が存在しないと shRNA の成熟が妨げられ、Venus の発現とコードされた各 shRNA の効力の間の共役が効果的に分離されました。全体として、我々は、感染多重度（MOI）0.8で、我々のライブラリーをコードするレトロベクターを用いて、120万個のDicernull/null 293FT細胞に形質導入した。感染の 3 日後、合計 5,000 万個の細胞から 400 万個の Venushigh Dicernull/null 293FT 細胞を FACS で選別しました。これらの細胞は、ゲノム遺伝子座への構築物の組み込みが成功した例を表しており、これは適切な Venus 発現によって反映されています。次に、合成構築物を使用してDicerの発現を回復し、DICER発現を調節して光シグナルと各shRNAの効力を結合させました（図1d）。合成構築物は、ヒト Dicer と変異型ヒト FKBP12 タンパク質に基づく不安定化ドメイン (ddDicer) との融合であり、Shield-124 を使用して Dicer の活性をダイヤルアップすることが可能になりました。さらに、Dicer に対する siRNA を使用して、逆の効果を誘導し、その発現を減少させました。これらのさまざまな条件の背後にある主なアイデアは、RNAi 機構が非常に強力な shRNA による標的の阻害を可能にするが、RNAi 機構が弱すぎて強力ではない shRNA の活性をサポートするレジメンを特定することでした。

合計で、ddDicer 発現の 8 つの異なる条件にわたってライブラリをスクリーニングしました (図 1e)。 T0 として割り当てた最初の条件には ddDicer がなく、操作されていないさまざまな shRNA の相対的な存在量を反映していました。他の条件には、Shield-1 (ddDicer 活性化を誘導するため) または抗 Dicer siRNA (Dicer を阻害するため) のいずれかの用量を増加させた条件が含まれていました。これら 7 つの条件をそれぞれ 2 つの生物学的複製に適用しました。次に、各複製内の細胞を、Venus 発現に基づいて 3 つのビン (高、低、暗) に分類し、続いて shRNA のレベルと正体を解読するために低および暗のビンの配列を決定しました。また、最初のライブラリーにおける shRNA の分布を示すために、T0 未選別 shRNA の配列も決定しました。全体として、(2[複製] × 2[ソートビン] × 4[ダイサー発現レベル] + 1[T0] =) 17 個のシーケンシングライブラリー (Illumina MiSeq) が得られ、それぞれが 150 bp のペアエンドリードで構成されました。合計すると、各ライブラリーで平均 3,600 万件のリードが得られました。これらのライブラリーからターゲットに対応する 50 塩基対の領域を解析し、shRNA に注釈を付けて戻し、各条件での各 shRNA の固有の出現数を数えました。最後に、DESeq225 を使用して、T0 に対する各条件での shRNA の濃縮を測定し、2 つの生物学的複製を平均しました。このプロセスにより、8×17,589の行列が得られました（図1f）。各列はshRNAを表し、各行は治療の1つ（siRNAまたはShield-1、低と暗の2つの分類ビンの1つを表します）を表します。 )、濃縮統計量 (右端の列) は、DESeq2 によって計算された曲線下面積 (AUC) で表されました。

次に、内部対照を使用して、高強力な shRNA をライブラリーの残りの部分から分離する最適なパラメーターを特定しました (図 1f、g)。 DESeq2 濃縮統計を使用して、強力でないコントロールと非常に強力なコントロールを区別するための AUC を計算しました。一般に、このプロセスは、高効力コントロールと不良コントロールを区別するという点で、低金星ビンが暗ビンよりも実質的に優れていることを示しました。さらに、Shield1 を含む条件は Shield-null 条件よりも優れたパフォーマンスを示し、10 pM および 100 pM の濃度が最も優れたパフォーマンスを示しました。したがって、新規の非常に強力な shRNA とパフォーマンスの低い shRNA を区別する最適な条件として、低いヴィーナスゲートを持つこれら 2 つの条件に焦点を当てることにしました。シーケンスカバレッジが高い RNAi トリガーに焦点を当てた後、これら 2 つの条件では、内部対照の AUC スコアが 80% に近づきました。さらに重要なのは、リコールをリストの上位 5% に制限した場合、これら 2 つの条件は内部対照に対して完全な陽性的中率 (PPV) を示しました。

最適なパラメーターを特定した後、内部対照に使用したものと同様のプロセスを使用して、候補となる SARS-CoV-2 shRNA をランク付けしました。各 shRNA について、同じシーケンスカバレッジ制限の下で各条件の DESeq2 統計を使用しました。最終結果は、テストしたすべての条件にわたる shRNA のランク付けされたリストで、最も強力な shRNA が一番上、最も強力でない shRNA が一番下になりました。

次に、複数の方法を使用して画面のランキングを検証しました。まず、最も優れた 2 つの条件にわたる SARS-CoV-2 shRNA 統計テスト間の相関関係を分析しました。この分析により、報告された 2 つの条件の統計間のピアソン相関が 72.2% (p < 10-9) であることがわかり、スクリーニング結果に有意な内部一貫性があることが示されました (図 2a)。次に、shRNA の配列の特徴に焦点を当てました。以前の研究では、非常に強力な shRNA は通常、ガイドの 20 番目の位置にアデニンが存在しないことと関連していることが報告されています 22。したがって、2 つの条件からの平均スクリーンスコアの関数としてアデニンの頻度を評価しました。この分析により、20位にアデニンを持たないSARS-CoV-2 shRNAの頻度と平均スクリーニング統計量との間に有意な相関関係（ピアソン = 90.4％、p < 10−20）が明らかになりました（図2b）。実際、私たちのスクリーニングの上位の shRNA は、事実上すべて 20 位のアデニンが枯渇していました。最後に、私たちはスクリーニングの結果を、公開されている機械学習アルゴリズムによって生成されたインシリコでの shRNA 効力予測と比較しました 26 (図 2c)。これらのアルゴリズムの予測は、個々の RNAi トリガーごとに完璧とはほど遠いものの、このアルゴリズムのスコアと平均スクリーニングスコアの間には非常に有意な相関関係 (ピアソン = 90.6%、p < 10−20) が見つかりました。

a スクリーンスコアは内部的に高い一貫性を持っていました。スクリーニングの結果は、2 つの最高パフォーマンス条件のスコア間のピアソン相関が 72.2% であることを示しました。 b 強力な shRNA に関連する機能の強化。 SARS-CoV-2を標的とするRNAiトリガーの位置20にアデニンが見つからない確率は、スクリーニングスコアが増加するにつれて増加し、アデニンが位置20を占めるとshRNAの成熟を弱めることを示した以前の研究を要約した。 c スクリーニングスコアはバイオインフォマティクス予測と高度に相関しています。 DESeq2 によって計算された濃縮統計を表すスクリーニングスコアは、shRNA の効力を予測する公開された機械学習アルゴリズムと高度に相関していました。 d スクリーニング結果と選択された候補。グラフは、ウイルスゲノムに沿った位置の関数として、品質閾値を超えた各 RNAi トリガーの結果として得られたスクリーニングスコアを示しています。オレンジ: RNAi は、SARS-CoV と SARS-COV-2 の間の保存領域を標的とするトリガーを引き起こします。緑: 選択された 10 人の候補者。青: 他のすべての RNAi リガー。 e 選択された 10 個の候補の用量反応曲線。 siRNA はレポーターアッセイを使用してテストされました。プロットは、mCherry (レポーター遺伝子) と GFP (コントロール遺伝子) の発現間の標準化された中央値比を表します。 f 選択した 10 人の候補者それぞれの能力スコア。 10 個の候補のそれぞれの IC50 値は、(e) の用量反応曲線に基づいて計算されました。 IC50 計算の標準誤差は、各濃度レベルのすべてのデータポイントにわたる統計的ブートストラップを使用して計算されました。

これらの結果に勇気づけられて、さらなる実験のために手動で 10 個の候補を選択しました (表 1、図 2d)。最初の 5 つの候補 (S1 ～ S3 および S5 ～ S6) は、複数のウイルス遺伝子を代表するように努めながら、主に 2 つの最もパフォーマンスの高い条件での平均スクリーニングスコアに基づいて選択されました。他の 5 つの候補 (S4 および S7 ～ S10) もスクリーニングスコアに基づいて選択されましたが、これらの領域が将来のウイルスに適用できる可能性があると仮説を立てたため、SARS-CoV と SARS-CoV-2 の間で完全に保存された 22 mer 領域に限定されました。ベータコロナウイルスの波及も。最終候補に挙げられた shRNA をテストするために、その標的領域を mCherry の 3'UTR にクローニングし、各 shRNA を対応する siRNA に変換しました。次に、各レポーターに対応する siRNA の用量を減らしてトランスフェクトし、その最大阻害濃度の半分 (IC50) を特定しました。試験した10個のsiRNAのうち8個は50pM未満のIC50値を示し(図2e、f;補足表2)、そのうち5個は20pM未満のIC50値を示した。このアッセイでは、1 つの候補 S9 のみが比較的低い IC50 値を示しました (IC50 > 1.4uM)。全体として、これらの結果は、我々の新しいゲノムワイドスクリーニング法が単一サイクル内で非常に強力なsiRNAを同定することを示しています。

Sens.AI スクリーニングと並行して、SARS-CoV-2 に対する siRNA を同定するために、より伝統的な発見パイプラインを採用しました。私たちの動機は、最先端の siRNA 予測アルゴリズムと比較して、新しい Sense.AI パイプラインのパフォーマンス統計、技術的特性、ロジスティック特性を評価することでした。この目的を達成するために、我々は 3 つのオープンソース siRNA 効力予測アルゴリズム (RNAxs27、DSIR28、OligoWalk29) を使用して、SARS-CoV30、31、32 に対して以前に良好な結果を示した領域に焦点を当て、815 を超える潜在的な標的部位をコンピューターで評価しました。アルゴリズム間の相関は比較的低く、スピアマン相関は 0.4 ～ 0.02 でした (補足図 3)。次に、ヒトのトランスクリプトームに相補的なシード領域を持つ候補を除外して、すべてのプログラムで一貫して優れた siRNA 候補を手動で選択しました。このリストから 88 個の siRNA が得られ、これらを合成し、上記と同じレポーターアッセイ (候補あたり 1 nM) でテストしました。次に、最も有望な 27 個の siRNA に優先順位を付け、500 pM および 100 pM の濃度で再テストしました (補足図 4)。これらの 27 個の候補のうち 9 個がレポーター発現を 50% (100 pM) 以上阻害することがわかりました。

次に、ゴールドスタンダードの生 SARS-CoV-2 in vitro 感染アッセイを使用して、センサースクリーンとバイオインフォマティクスパイプラインから上位の候補を評価しました。 Vero E6 細胞に 100 nM の各 Sens.AI siRNA 候補を 3 回トランスフェクトしました。ネガティブコントロールとして、eGFP を標的としたモック siRNA を細胞にトランスフェクトしました。 24 時間後、60xTCID50、600xTCID50、または 6000xTCID50 の生きた SARS-CoV-2 (祖先株) で細胞を攻撃しました。最後に、最初の感染から 48 時間後のウイルス量のレベルを qPCR で測定し、RdRP 遺伝子と E 遺伝子を調べました。

私たちのスクリーニングでテストした 9 種類の siRNA のうち 6 種類が、ウイルス RNA の量を劇的に減少させることができることがわかりました。結果は、テストした3つのウイルス力価すべてで定性的に一貫していましたが（図3および補足図5a、b）、最大のダイナミックレンジが得られたため、今後の実験では600xTCID50力価に焦点を当てることにしました（図3a）。これらの条件では、当社の最も優れた 5 つの siRNA がゲノムウイルス量を 95% 以上抑制しました。興味深いことに、レポーターアッセイにおける非常に高い効力（IC50 < 20 pM）にもかかわらず、S8 と S10 は両方とも、対照 siRNA と比較して約 10% の SARS-CoV-2 阻害レベルで弱い応答を示しました。ただし、他の siRNA 候補とは異なり、これら 2 つは複製プロセスの仲介者であるウイルスのマイナス鎖を標的とします。したがって、この中間 RNA 分子を標的にしてもウイルスの複製は妨げられない可能性が高いと我々は仮説を立てました。上位候補をさらに確認するために、TCID50 アッセイを使用して細胞内の生ウイルス感染力に対する影響を評価しました (図 3b)。ここでも、4 つの siRNA のうち上位 3 つの強力な阻害活性が見つかり、ウイルス抑制は GFP siRNA コントロールと比較して約 2 桁の大きさを示しました。次に、同じ設定を使用して、オープンソースの発見方法からの 5 つの最も強力な siRNA をテストしました (補足表 3)。 1 つの候補である Hel14 のみが、Sens.AI スクリーニングの上位 siRNA によって示されたレベル (約 90% 阻害) と同等の、95% 以上のウイルス量の抑制レベルを示しました (図 3c)。

青とオレンジ: それぞれ E 転写産物と RdRP 転写産物の qPCR 結果。特に断りのない限り、100% ウイルス負荷は、抗 GFP siRNA での処理後のウイルスレベルに校正されました。 Sens.AI スクリーニングの上位 siRNA 候補で処理した後の SARS-CoV-2 (祖先株) のウイルス量。 b 上位 4 つの siRNA 分子による処理後の SARS-CoV-2 (祖先株) の TCID50 レベル。実験の各バッチでは、eGFP に対する siRNA をネガティブコントロールとして使用しました (左パネル n = 3、右パネル n = 1、エラーバー = SEM、有意性は t 検定を使用して計算しました)。 c バイオインフォマティックスパイプラインからのトップsiRNAによる処理後のSARS-CoV-2（祖先株）のウイルス量。 d SARS-CoV-2（祖先株）に対するさまざまなsiRNAカクテルの効果。結果は、同じ濃度での S3 の抑制に合わせて調整されました。 e ALI培養物におけるsiRNAカクテルによる処理後のSARS-CoV-2（祖先株）のウイルス量。感染後48、72および96時間で培地から収集した培地中のウイルス量を測定した(n = 2の独立したサンプル、エラーバー=SEM)。 f SARS-CoV-2 Delta 対祖先株に対する siRNA カクテルによる処理後のウイルス量 (n = 3 の独立したサンプル、エラーバー = SEM)。 g S5/Hel14 カクテルおよび他の種類の抗ウイルス薬による治療後の SARS-CoV-2 オミクロンと祖先株のウイルス量。 (h) S3/S5 siRNA カクテルによる SARS-CoV-2 レプリコン処理の DeSEQ2 分析。レプリコン配列に沿った S3 (約 23.5 kbase) および S5 (約 28 kbase) 切断部位付近でカバレッジが急激に減少することが観察されました (FDR 値はそれぞれ 4 × 10−83 および 6 × 10−22)。パネル ef のエラーバーは、3 回の反復に基づく標準偏差を表します。

次に、最もパフォーマンスの高い候補の中から siRNA ペアの最適な組み合わせを検索しました。これらのカクテルには、Sens.AI スクリーンからの 4 つの siRNA が含まれており、オープンソースの発見パイプラインからの最も有望な 3 つの siRNA が追加されています。生ウイルスアッセイで 14 種類の異なる 2-siRNA カクテルをテストし、単剤療法として最も高い抑制レベルを示したため、結果を S3 単独による抑制と比較しました (図 3d)。我々は、2 つの siRNA 成分が同じ濃度での S3 単独による抑制と比較して数倍の相乗効果を示す 5 つのカクテルを同定しました。 S5 はこれらのカクテルのほとんどでリピートコンポーネントであることが判明し、今後はこれらのカクテルのうち 2 つ、S5/S3 と S5/Hel14 を優先することにしました。

これらの siRNA カクテルをさらに検証するために、VeroE6 細胞と比較して気道をよりよく模倣する気液界面培養でその活性をテストしました。 ALI培養物を頂端側から100nMの各カクテルでトランスフェクトしました。ネガティブコントロールとして、eGFP を標的としたモック siRNA を細胞にトランスフェクトしました。 24時間後、細胞の頂端側から600xTCID50の生きたSARS-CoV-2（祖先株）をチャレンジしました。最後に、最初の感染から 48、72、および 96 時間後のウイルス量のレベルを qPCR によって測定し、RdRP および E 遺伝子を調べました。これらの条件下では、両方のカクテルでウイルス複製が強力に阻害されることがわかりました（図3e）。

私たちのカクテルは、新たな VoC に対して非常に耐性があることが証明されました。まず、祖先株とデルタ変異体に対してカクテルをテストしました。このカクテルは、祖先株に対する効果と同等の、デルタ株に対する実質的な抑制をもたらしました（＞95％抑制）（図3f）。興味深いことに、S5 は標的部位の 14 位に変異があるにもかかわらず、デルタ株に対して耐性があり、有効性を示しました。次に、同様の設定を使用して、S5/Hel14 カクテルを Omicron BA.1 に対してテストしました。他の報告と同様に 33、Omicron 変異体は in vitro で他の VoC ほど速く複製しませんでした。これらの低い複製速度によりアッセイのダイナミックレンジが減少したため、2 つのポジティブコントロール、クロロキンとモルヌピラビルを追加しました。これらは両方とも Omicron BA.1 の強力な阻害剤であることが実証されました。 S5/Hel14 カクテルの活性は、Omicron 変異体では実際に減少しました。それにもかかわらず、それは、陽性対照処理によって誘導されたのと同様のレベルまでウイルス複製を阻害した（図３ｇ）。この発見は、より穏やかな阻害は、RNAi カクテル自体の効力の低下によるものではなく、ウイルス複製の遅さによるダイナミックレンジの低下の結果である可能性が高いことを示唆しました。最後に、私たちの新しいレプリコンシステムに対するカクテルの活性をテストしました。これにより、ベータ SARS-CoV-2 株の機能は再現されましたが、感染力は再現されませんでした 34。一貫して、カクテルはレプリコンを 10 ～ 15 倍抑制し、さまざまな VoC にわたって強力な阻害プロファイルを与えることが示されました 34。重要なことに、ハイスループットシークエンシングデータの分析により、S3/S5カクテルで処理した細胞はsiRNA切断部位でのリードの枯渇という特異的なプロファイルを示すことが示されました（図3h）。これらのデータは、観察されたウイルス量の減少が siRNA サイレンシングに直接関係していることを確認するための機構的な裏付けを提供します。

次に、パンデミックへの備えという文脈での使用目的を考慮して、将来の VoC に対する RNAi 戦略の交差反応性を調査しました。この目的を達成するために、当社は Sens.AI 戦略を使用した飽和突然変異誘発アッセイを開発しました。 SARS-CoV-2 スクリーニングと同じ RNAi-off/RNAi-on 戦略を繰り返しました。唯一の違いは、前のスクリーニングではさまざまなshRNAトリガーと完全に一致する標的部位を使用したのに対し、このアッセイではshRNAトリガーをS5のものに固定し、一連の変異した標的部位を作成したことです（図4a）。。この戦略を使用して、S5 標的部位の 2,143 個の変異をスクリーニングし、この部位のほぼすべての可能な 1 つおよび/または 2 つの置換を徹底的に評価しました。私たちの知る限り、これは RNAi トリガーを用いてこれまでに実施された最大のセルロ内飽和突然変異誘発です。

a この設定で使用されるオリゴの設計スキーム。ライブラリーは、2,143 個の変異を持つ shRNA トリガーとしての S5 で構成され、siRNA 標的部位における考えられる単一および二重ミスマッチをすべて網羅的に示しています。 b 単一のミスマッチを含む n = 66 shRNA の位置によって階層化されたミスマッチの影響。 X 軸はガイドストランドに沿った位置を表します。青: 平均値。黄色: 平滑化された平均効果。正方形は平均を表し、水平線は中央値を表し、ボックスの端は 25% と 75% の四分位を表し、ひげは四分位範囲の最大 50% 内の最も遠いデータポイントを表します。 c S5 の活性に対する突然変異の影響の分布。 1.0 の垂直線 (X 軸) は、変異のない標的部位のスクリーニングスコアと同一のスコアを示します。黒: 2143 個すべての一重および二重変異の影響の分布。灰色: すべての単一突然変異の分布。オレンジ: すべての二重遷移の分布。赤: すべての二重トランスバージョンの分布。

我々は、siRNA ターゲットの不一致に関する以前の傾向を再現することにより、飽和変異誘発スクリーニングを検証しました。不一致の数に基づいて結果を層別化しました。平均して、ターゲットサイトに 1 つの不一致があると、不一致がない場合と比較して Sens.AI スコアが 6% 低下します。予想通り、この数値は二重ミスマッチで観察された数値よりも大幅に小さく (t 検定、p < 3 × 10−10)、Sens.AI スコアが平均 31% 減少しました。次に、単一ミスマッチの位置が S5 の活性に与える影響を分析しました (図 4b)。同様に、以前の研究 35 と一致して、シード領域はミスマッチに対して最も高い感受性を示しましたが、切断部位はこれらの変異に対して比較的低い感受性を示しました。

全体として、私たちのハイスループットスクリーニングは、S5標的部位が効力を大幅に失うことなくさまざまな突然変異を許容できることを示しました（図4c、補足図6）。ほとんどの単一変異 (56%) は Sens.AI スコアを向上させ、S5 効力を増加させると予想され、これは Ago2 解離ダイナミクスに起因すると考えられます 35。対照的に、標的部位に二重変異があった場合、S5 はその効力の大部分を失うと推定しました。これらの二重変異のダイナミクスをより深く理解するために、二重転移の推定効果を二重転移と比較しました。私たちの結果は、二重遷移のほうがはるかに忍容性が高いことを示しています。ほとんどの二重トランジションでは Sens.AI スコアが 32% 未満減少しましたが、ほとんどの二重トランジションではこのスコアが 51% を超えて減少しました。以前の研究に基づくと、前者の変異タイプは後者の変異タイプより 7 倍一般的であり 36 、これは S5 が標的部位におけるより一般的なタイプの二重変異をある程度許容できることを示唆しています。

新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の疾患モデルにおける当社の siRNA カクテルの予防効果を評価するために、生ウイルス攻撃に対する先制措置として S5/Hel14 カクテルをシリアンハムスターに投与しました。 S3 はワクチンおよび mAb 回避機構として突然変異を起こしやすい Spike コード領域を標的としているため、S3/S5 カクテルではなくこのカクテルを使用することにしました。我々は、独自の肺選択的送達製剤を使用して、-7、-3、および-1日目に1日当たり約400μg/kgのsiRNAカクテルを1回投与することからなる投与計画を採用した。さらに、同じ投与計画を使用して、陰性対照として、C型肝炎ウイルス（HCV）に対する既知の非常に強力なsiRNAで別のグループのハムスターを治療しました。陽性対照として使用できる鼻腔内薬がないため、-1日目にバムラニビマブ37（LY-COV555、新型コロナウイルス感染症治療のためにFDAから緊急使用許可を受けている）を陽性対照に腹腔内（ip）投与した。グループ。各グループは6匹の雄ハムスターで構成され、0日目にWA-1祖先SARS-CoV-2株の4×103PFUを鼻腔内に投与しました。

我々の結果は、ゴールドスタンダードのシリアンハムスター疾患モデルにおいて、siRNAカクテルが曝露前予防法（PrEP）として使用された場合、SARS-CoV-2感染に対する防御をもたらしたことを示している（図5a）。陰性対照群は、以前の研究と一致して、感染後 5 日目に平均 7% 以上の体重減少を示しました 38、39、40。 siRNA治療群は、この陰性対照群と比較して、体重減少に対する有意な保護の恩恵を受けました（p < 0.05;ブートストラップ仮説検定およびボンフェローニ調整）（図5b）。この体重減少は、バムラニビマブで治療された陽性対照群と統計的に区別できませんでした。さらに、RdRP 遺伝子の qPCR 測定によって測定したところ、陰性対照と比較して、積極的治療群 (5 日目) の肺におけるウイルス量の抑制が観察されました (ΔVLlung = 10.3x、肺値 < 0.001;ブートストラップ仮説テストとボンフェローニ調整) (図 5c)。同様に、程度は低いものの、鼻孔内のウイルス量の有意な抑制も観察されました（ΔVLlung = 2.5x、plung < 0.05; ブートストラップ仮説検定およびボンフェローニ調整）（図5d）。どちらの場合も、抗体は siRNA 治療よりも効果的であり、siRNA カクテルを実行可能な予防薬として完全に開発するには、追加の用量最適化研究が必要であることが示唆されています。

投与計画。ノンターゲティング siRNA (ネガティブコントロール、灰色)、LY-CoV555 抗体 (ポジティブコントロール、黄色)、または当社のリード siRNA カクテル (治療、赤色) で前処理したシリアンハムスター (n = 6、グループあたり) に感染しました。祖先型 SARS-CoV-2 株の 4 × 103 PFU。 b 感染後の体重変化。感染後の時間に対する治療グループ別の体重変化の箱ひげ図。 c、d 感染後5日目のウイルス量。すべての測定は、感染後 5 日目の均質化された肺 c および鼻孔 d からの RdRP 遺伝子の qPCR に基づいていました。すべてのパネルで、p 値は次のように表示されます: *<0.05、**<0.001。 Ctrl: コントロール; VL: ウイルス量。陰性: 陰性。正: 正; 治療: 治療; ns: 重要ではありません。パネル b ～ d では、水平線は中央値を表し、ボックスの端は 25% と 75% の四分位を表し、ひげは四分位範囲の最大 50% 内の最も遠いデータポイントを表します。 P 値は、パラメトリックブートストラップを使用して計算されました (方法)。

また、同じ siRNA カクテルを 3 つの追加形式でテストしました。鼻腔内投与される化学修飾 siRNA (バリエーション #1、補足図 7)、噴霧によって投与される同じ化学修飾 siRNA (バリエーション #2)、および噴霧によって投与される裸の siRNA (バリエーション #) 3) (方法)。治療バリエーション#1と#2の両方で、肺のウイルス量の有意な減少が示されました（肺変動#1 < 0.001; 肺変動#2 < 0.001; ブートストラップ仮説検定およびボンフェローニ調整）（補足図8a）。さらに、鼻孔のウイルス量の小さいながらも有意な減少が見つかりました（急落変動#1 < 0.001; 急落変動#2 < 0.05; ブートストラップ仮説検定およびボンフェローニ調整）（補足図8b）。しかし、これらの変動はいずれも、5日目に測定した体重減少を防ぐ効果はなく（補足図8c）、これらの変動は一次治療群よりも遅い薬物動態を示すか、忍容性課題を誘発する可能性があることを示唆しています。

まとめると、我々の結果は、siRNA治療がSARS-CoV-2感染から上気道を効果的に保護し、ウイルス量の測定と体重減少によって典型的に例示される臨床症状に反映されるように感染を大幅に軽減できることを示している。

予防、特に懸念される新規変異種（VoC）の出現に耐性のある予防は、継続する新型コロナウイルス感染症のパンデミックと戦うために使用される治療法に欠けている要素として繰り返し指摘されてきた。 siRNA は予防治療に魅力的な手段を提供し、実際、最初の SARS 流行の際に、さまざまな研究者がウイルスゲノムを標的とする siRNA を特定しました。それにもかかわらず、9,000 以上の公開された配列のうち、SARS-Cov2 ゲノムと完全に一致する siRNA は 12 個だけでした。この研究では、我々の知る限り初めて、SARS-CoV-2に対する体系的なゲノムワイドRNAiスクリーニングについて報告する。私たちは、大規模並列レポーターアッセイで 16,000 を超える RNAi トリガーをテストし、in vitro ライブウイルスアッセイで最も優れたパフォーマンスを発揮するものを検証しました。さらに、オープンソースのインシリコ発見法によって同定された 88 個の siRNA をテストしました。次に、siRNA 成分が組み合わされたときに相乗効果をもたらす例を特定するために、生ウイルスアッセイで複数の siRNA ペアをカクテル処理としてテストしました。これらのカクテルは、ベータ型、デルタ型、および祖先型のウイルスの 3 つの異なる株に対して有効であることが証明されました。標的部位の 1 つにおける 2,143 個の単一および二重変異すべてを徹底的にスクリーニングした結果、将来の VoC に対する活性が失われる可能性が低いことがさらに確認されました。最後に、我々はシリアンハムスターにおけるSARS-CoV-2感染に対する曝露前予防薬としてのこれらのカクテルの有効性を示した。

私たちの研究にも一定の限界があります。まず、現在の体制では、siRNA カクテルは急性期の予防薬として設計されました。どれくらいの期間効果が持続するかは不明であるため、最前線の労働者、免疫抑制（一過性または慢性）、家庭内での流行、感染症の流行など、高い曝露リスクが存在する状況に最も適している可能性があります。高さや感染の「波」。第二に、当社の siRNA カクテルはシリアンハムスターを病気から保護しましたが、その効果は主に上気道で観察されました。これは主な感染部位であり、伝播を軽減するという点で大きな期待が寄せられていますが、治療現場での使用にはさらなる適応が必要であり、下気道から肺実質までの送達を最適化する必要があります。第三に、この原理実証研究の目的で、感染前の複数日間の投与で構成される曝露前治療計画を採用しました。私たちは、NHP、そして最終的にはヒトでの臨床試験に進む前に、レジメンをさらに最適化することを目指しています。

これらの注意点にもかかわらず、今回の研究は、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）だけでなく、同様の死亡率と罹患率の将来の他のウイルス性パンデミックを抑制するための世界的な取り組みに大きく貢献する。本明細書では、原因となる病原体のおそらく突然変異の進化に対する耐性のある曝露前予防薬としての、鼻腔内投与されたsiRNAカクテルの有効性を説明する。これは、現在、中和モノクローナル抗体およびワクチンクラスの治療に耐性のある新規の SARS-CoV-2 変異体の出現を驚くべき速度で目撃していることを考えると、特に心強いことです。重要なのは、私たちが提案するアプローチはスパイク変異の影響を受けず、機能的な免疫システムにも依存しないことです。その代わりに、感染伝播の中心となる気道の内層上皮細胞で活性な天然のRNAi経路を利用しており、ワクチンや他の免疫調節アプローチとは完全に直交しています。最後に、現在のパンデミックの世界的規模と、多くのワクチンおよびモノクローナル抗体承認治療法に関連する制限的なコールドチェーン保管および出荷要件を考慮すると、アクセスが困難な地方でも利用できる耐久性のあるソリューションが緊急に求められています。裕福でない人々。当社の鼻腔内投与により、アクセシビリティのための新規または高度な医療インフラに依存することなく、広範な展開が可能になります。私たちは、この研究がパンデミックへの備えへのアプローチにおけるパラダイムシフトを示していると信じており、私たちの発見と検証のパイプラインは、新型ベータコロナウイルスやインフルエンザなど、他の新たな病原体の脅威にも適用できると期待しています。

HEK293FT (ThermoFisher Scientific) および VeroE6 (ATCC) 細胞 (およびその派生細胞) を、10% ウシ胎児血清、100 U/ml ペニシリンおよび 100 μg/ml ストレプトマイシンを添加した DMEM (ダルベッコ改変イーグル培地) で増殖させました (すべて Thermo Fisher科学的)、37 °C、5% CO2 で。 HEK293FT 細胞株は Thermo Scientific から入手しました (カタログ番号 R70007)。気液界面培養物 (MucilAir) は Epithelix から購入しました。

HEK293FT-Dicer ノックアウト (KO) 細胞株は、親 293FT 細胞株において CRISPR/Cas9 によって操作されました。ガイド RNA (gRNA) は次の配列を持っていました: AAGAGCUGUCCUAUCAGAUC。 gRNA はヌクレアーゼ分解を防ぐためにホスホロチオエート修飾で修飾されており、Merck-Millipore から入手しました。 80 pmol の gRNA を 4 μg の TrueCut Cas9 タンパク質 (ThermoFisher) と複合体化し、Amaxa nucleofector を使用して細胞にトランスフェクトしました。 KO効率はサンガー配列決定法を使用して決定されました。

各候補 siRNA について、150 塩基対のコンテキスト内でその標的配列を抽出しました。標的配列を、構成的に発現されたmCherryレポータータンパク質の3'UTRでpLMN-ZsGreen-Neomycin (Transomics)にクローニングした。 HEK293FT細胞を、製造業者のガイドラインに従って、センサー単独、またはセンサーと関連する濃度のsiRNAのいずれかを用いて、リポフェクタミン3000(Life Technologies)でトランスフェクトした。 eGFP を発現する 2 番目のプラスミドを 1:1 のモル比で同時トランスフェクトし、トランスフェクション効率の内部対照として機能させました。細胞を収集し、トランスフェクションの48時間後にMACSquant VYBフローサイトメーター(Milteyi Biotec)を使用して分析した。各候補の効力は、mCherry 対 eGFP 放射輝度振幅の中央値として評価されました。補足図 9 は、この実験で使用されたゲート戦略を示しています。

shRNA センサーライブラリは 2 段階の手順で構築されました。各 shRNA が EcoRI および MluI 制限部位を含むリンカーによって同族センサーに結合されている約 20,000 個のオリゴヌクレオチドのライブラリーを Twist Bioscience から入手しました。ライブラリーは最初に PCR 増幅され、レシピエントレトロウイルスベクター内の XhoI および MfeI を使用してクローン化されました。後者には、その 5' 部分 (5' mir30) を含むハイグロマイシン耐性 miR30 が含まれていました。第 2 ステップでは、3' mir30-PGK-Venus カセットを shRNA とそのセンサーの間に挿入し、リンカーの EcoRI および MluI 部位を介して組み込みました。

レポーターアッセイおよび不安定化ダイサー用のすべてのプラスミドは、Transomics から入手したレンチウイルス pZIP 足場 (pZIP-SFFV-ZsGreen-Puro) 上に構築されました。この足場は、EF1α プロモーターのみで SFFV-ZsGreen カセットを切り替えるように事前に改変されていました。レポーターアッセイでは、ギブソンクローニングを介して EF1aplha プロモーターの下流に発現カセットをクローニングしました。これは、3xFLAG-EGFP-NLS または mCherry-STOP-150bp センサーフラグメントのいずれかで構成されていました。不安定化された ddDicer については、不安定化ドメイン 41 とヒト Dicer142 が PCR によって増幅され、3 ウェイギブソンクローニングによって pZIP-EF1aplha に組み立てられました。最終的な構築物は、次の構造 EF1a::dd-Dicer1-IRES-Puro を持っていました。

生きたウイルスを使ったすべての in vitro 研究は、ケンブリッジ治療免疫感染症研究所 (CITIID) の封じ込めレベル 3 施設で、承認された標準操作手順およびプロトコルに基づいて実施されました。

WT として指定された第一波分離株である Sars-cov-2/human/Liverpool/REMRQ001/2020 の臨床分離株は、Vero-E6 で増殖し、この研究では主に生ウイルス感染に使用されました。新たに出現したデルタとオミクロンの亜種を使用して追加の実験が行われました。増殖した感染性の生きた SARS-CoV-2 ウイルス、B.1.1.617.2 (デルタ) および B.1.1.529 (オミクロン) は、一部としてウェンディバークレー教授 (インペリアルカレッジロンドン) およびジョナサンブラウン博士 (インペリアルカレッジロンドン) から提供されました。 G2P-UK National Virology Consortium によって実施された研究の結果。オックスフォード大学の Gavin Screaton 氏のご厚意により寄贈された、Omicron 変異体と一致するウイルス分離株を、細胞変性効果が観察されるまで 3 日間、Vero-ACE2-TMPRSS2 (VAT) 細胞上で増殖させました。

コントロール GFP または実験用 siRNA をトランスフェクトした Vero E6 細胞を 96 ウェルで調製しました。別段の指示がない限り、10,000 個の VeroE6 細胞を 100 nM の siRNA 処理でトランスフェクトし、siRNA 処理の 24 時間後に SARS-Cov-2 に感染させました。既知のSARS-CoV-2阻害剤の有無にかかわらず、50μlのDMEM中で細胞あたりMOI 1または0.1 TCID50でSARS-CoV-2 WT、Delta、およびOmicron変異体のいずれかを生物学的三重反復で細胞に感染させた。感染を感染後 48/72 時間（pi）までインキュベートし、細胞培養上清を感染後 0、24、48 および/または 72 時間で回収し、ウイルス RNA を RT-qPCR で定量し、感染性ウイルス単位を RT-qPCR で滴定しました。 TCID50。その後、４０μｌの培地を１６０μｌのＴＲＩｚｏｌ（商標）ＬＳ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中に直接回収した。 Direct-zol-96 RNA キット (ZYMO Research) を使用してウイルス RNA を抽出し、ウイルスのコピー数を測定するための qRTPCR のテンプレートとして使用しました。クロロキン二リン酸（BioVision）は最終濃度50μMで使用し、モルヌピラビル（Focus Biomolecules）は最終濃度20μMで使用した。ベータレプリコンの配列決定については以前に説明しました 34。

収集したウイルス上清の 10 倍段階希釈物を DMEM 培地で調製しました。これらの希釈液のうち、50 μl を 96 ウェルプレート上で増殖させた Vero E6 細胞の単層に接種し、5 % CO2 インキュベーター内で 37 °C でインキュベートしました。ウイルス力価は感染後 4 日目に収集され、Reed-Muench 法により TCID50 ml-1 値として表されました 43。

ウイルスゲノムのコピー数は、Charité/Berlin Primer Probe Panel (IDT) および TaqPath™ 1-Step Multiplex Master Mix (ThemoFisher) を使用した qPCR によって測定されました。次に、各条件の平均 Ct 値を eGFP siRNA の Ct 値と比較しました。

S5 突然変異誘発飽和アッセイ用のオリゴは Twist Bioscience から入手し、上記のように shRNA センサーライブラリーにクローン化しました。前のスクリーニングと同様に、Fellmann et al.22 からの 948 個のコントロール shRNA も組み込みました。511 個は非常に強力であり、437 個は低効力です。このスクリーニングは、いくつかの変更を加えたゲノムワイドスクリーニングと同様の構造に従いました: (a) 3 つの条件のみで RNAi 機構を調節しました: Dicer の上方制御、Dicer の下方制御、および変調なし。強力なコントロール shRNA と弱いコントロール shRNA を区別するために、機械学習パイプラインが構築されました。相互検証を使用して最良の分類器が選択され、平均 81.1% の精度率 (se は 1.14%) でした。分類子は、アッセイ内の各トリガーとターゲットのペアに効力スコアを割り当てます。各変異ターゲットの効果は、完全に一致したトリガー-ターゲットペアのスコアに対する変異トリガー-ターゲットペアの分類子スコアとして決定されました。

生後6～8週齢の雄ゴールデンシリアンハムスターを感染前-7、-3、-1日目にsiRNAカクテルで治療した。研究では、独自の製剤を使用してハムスターに鼻腔内（IN）投与を実施しました。各ハムスターを滅菌手術用パッドの上に置き、首筋をしっかりと掴めるように軽く伸ばしました。ハムスターが呼吸して快適に過ごせるように、ハムスターを仰向けにしました。首と顎を平らにしてパッドと平行にして、ピペッターの先端をハムスターの左鼻孔近くに 45 度の角度で置き、5 μL の投与物質を 2 ～ 3 秒で鼻孔に投与しました。間隔をあけて合計 25 μL/鼻孔を投与します。ハムスターを５秒間、または意識を取り戻すまでこの位置に保持し、その後、もう一方の鼻孔に合計５０μＬ／ハムスターの投与を繰り返した。処置後、ハムスターをケージに戻し、副作用がないか5〜10分間監視しました。

ネブライザー投与の場合、siRNA を PBS + ゼラチン 0.5 mg/ml で希釈しました。エアロゾルは振動マッシュ噴霧 (VMN) を使用して生成され、噴霧は生物学的安全キャビネット (BSC) で実行されました。

指示がある場合、1 mg の mAb555 を -1 日目に静脈内投与しました。 0日目に、4×103 PFUウイルスの鼻腔内感染を用いてハムスターをSARS-CoV-2に感染させた。感染後 5 日目にハムスターを屠殺し、さらなる分析のために気管と肺を採取しました。

各ハムスターからそのグループの平均を引き、各グループからハムスターを20000回置換して再サンプリングし、平均間の差が実際のサンプルよりも大きいサンプルの割合を計算することにより、ブートストラップ仮説検定によってすべてのp値を計算しました。違い。提示された p 値は、4 つのアームのボンフェローニ補正後のものです。

2つの複製（別々に選別されたセルとして定義）を使用して、最初のcovidスクリーニング（図1）を実行しました。各濃度で試験した各 siRNA について 2 つの複製 (別個のトランスフェクション実験として定義) を使用してスクリーニング検証 (図 2) を実行しました。各siRNAについて3回の複製（個別の細胞感染実験として定義）を使用して生ウイルス実験（図3）を実行し、ダネット検定を使用して統計分析を実行しました。 2,143 個の異なる siRNA を使用して飽和変異誘発解析 (図 4) を実行し、位置ごとに 3 つの異なるミスマッチをテストしました。グループごとに6匹のハムスターを使用して生体内実験（図5）を実行し、ブートストラップ仮説検定を使用して統計分析を実行しました（各ハムスターからそのグループの平均を引き、各グループからハムスターを20000回置換して再サンプリングし、分数を計算しました）平均間の差が実際の差よりも大きかったサンプルの数）。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

センサーアッセイ実験からのデータ、未処理データ、およびメタデータファイルは、ご要望に応じて入手可能です。グラフや図の元データは補足資料1～5に含まれます。

結果を再現するために必要なコードは、リクエストに応じて作成者から入手できます。

公衆衛生の専門家、臨床医、科学者のグループによる公開書簡。ovid-19: 世界的な「ワクチンプラス」行動の緊急呼びかけ。 BMJ 376、o1 (2022)。

記事 Google Scholar

クラマー、F. SARS-CoV-2 ワクチンは開発中。ネイチャー 586、516–527 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Dong, Y. 他 SARS-CoV-2 ワクチン候補の系統的レビュー。信号伝達。ターゲットサー。 5、237（2020）。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang、Z.ら。 SARS-CoV-2 および循環している変異株に対する mRNA ワクチン誘発抗体。ネイチャー 592、616–622 (2021)。

グリーニー、AJ 他ポリクローナルヒト血漿抗体による認識に影響を与える、SARS-CoV-2 受容体結合ドメインの変異の包括的なマッピング。細胞宿主微生物。 29、463–476.e6 (2021)。

ボーム、A.ら。 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質に対する抗体カクテルは、個々の抗体で見られる急速な変異回避を防ぎます。サイエンス 369、1014–1018 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Muik、A.ら。 BNT162b2 ワクチン誘発ヒト血清による SARS-CoV-2 系統 B.1.1.7 シュードウイルスの中和。サイエンス 371、1152–1153 (2021)。

ウー、Ｋら。 mRNA-1273 ワクチンは、世界的な SARS-CoV-2 変異株のスパイク変異体に対する中和抗体を誘導します。 bioRxiv 2021.01.25.427948 https://doi.org/10.1101/2021.01.25.427948 (2021) のプレプリント。

Chemaitelly、H. et al. カタールにおけるSARS-CoV-2感染に対するBNT162b2ワクチンの防御力の低下。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 385、e83 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Levine-Tiefenbrun, M. et al. SARS-CoV-2 ブースターのウイルス量削減効果の低下。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.12.27.21268424 (2021)。

フェルディナンズ、JM 他。デルタ変異体およびオミクロン変異体が優勢な期間における成人の新型コロナウイルス感染症関連救急部門および救急医療の遭遇および入院に対する mRNA ワクチンの 2 回投与および 3 回投与の有効性の低下 - VISION Network、10 州、2021 年 8 月～2022 年 1 月。MMWRモルブ。定命の者。ぎこちない。議員 71、255–263 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ガジット、S.ら。イスラエルにおけるBNT162b2ワクチンの3回接種と比較した4回接種の相対的な有効性。 bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.03.24.22272835 (2022)。

ガニエ、M.ら。ワクチン接種されたマカクザルにおける mRNA-1273 または mRNA-Omicron の追加免疫は、同様の B 細胞増殖、中和抗体、および Omicron に対する防御を誘発します。セル 185、1556–1571.e18 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

イン、B.ら。 Omicron 適合または従来の mRNA ワクチンで追加免疫すると、マウスの中和抗体反応と B.1.1.529 感染に対する防御が増加します。 bioRxiv プレプリントは https://doi.org/10.1101/2022.02.07.479419 (2022) にあります。

サン、Ｊ．ら。米国におけるSARS-CoV-2ワクチン接種後の免疫機能不全と新型コロナウイルス感染症との関連性。 JAMAインターン。医学。 182、153–162 (2022)。

ケンプ、SA et al. 慢性感染症の治療中の SARS-CoV-2 の進化。ネイチャー 592、277–282 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

コーリー、L.ら。免疫抑制患者における SARS-CoV-2 変異体。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 385、562–566 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、B.-J. 他。アカゲザルにおける SARS コロナウイルスに対する予防および治療レジメンにおける siRNA の使用。ナット。医学。 11、944–951 (2005)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tompkins, SM、Lo, C.-Y.、Tumpey, TM & Epstein, SL インビボでの RNA 干渉による致死性インフルエンザウイルス攻撃に対する防御。手順国立アカデミー。科学。アメリカ合衆国。 101、8682–8686 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DeVincenzo、J. et al. RS ウイルスに対する RNAi ベースの治療に関するランダム化二重盲検プラセボ対照研究。手順国立アカデミー。科学。アメリカ合衆国。 107、8800–8805 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bitko, V. & Barik, S. 呼吸器ウイルス疾患: RNA 干渉療法へのアクセス。ドラッグディスコブ。今日は。戦略。 4、273–276 (2007)。

論文 PubMed Google Scholar

フェルマン、C.ら。大規模並列センサーアッセイを使用した、最適化された RNAi トリガーの機能的同定。モル。セル 41、733–746 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

タン、Ｘら。病原性ウイルスのゲノムをタイリングすることにより、強力な抗ウイルス性 shRNA が同定され、shRNA の有効性における二次構造の役割が明らかになります。手順国立アカデミー。科学。アメリカ合衆国。 109、869–874 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Banaszynski, LA、Chen, L.-C.、Maynard-Smith, LA、Ooi, AGL & Wandless, TJ 合成小分子を使用して生細胞内のタンパク質機能を制御する、迅速で可逆的かつ調整可能な方法。セル 126、995–1004 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Love, MI、Huber, W. & Anders, S. DESeq2 を使用した RNA-seq データの倍数変化と分散の適度な推定。ゲノムバイオル。 15, 550 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Pelossof、R. et al. 逐次分類アルゴリズムによる強力な shRNA の予測。ナット。バイオテクノロジー。 35、350–353 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tafer, H. et al. 効果的な siRNA の設計に対する標的部位へのアクセスの影響。ナット。バイオテクノロジー。 26、578–583 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vert, J.-P.、Foveau, N.、Lajaunie, C. & Vandenbrouck, Y. siRNA 有効性予測のための正確で解釈可能なモデル。 BMCバイオインフォマ。 7, 520 (2006)。

記事 Google Scholar

Lu、ZJ & Mathews、DH OligoWalk: ハイブリダイゼーション熱力学を利用したオンライン siRNA 設計ツール。核酸研究所 36、W104–W108 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

鄭、B.-J. 他。 SARS コロナウイルスを標的とした低分子干渉 RNA の予防および治療効果。アンチビル。それで。 9、365–374 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アーケルストローム、S.、ミラジーミ、A.、タン、Y.-J. 特定の SARS タンパク質、7a/7b、3a/3b、および S. Antivir をサイレンシングする低分子干渉 RNA による SARS-CoV 複製サイクルの阻害。解像度 73、219–227 (2007)。

論文 PubMed Google Scholar

彼、M.-L. 他。 SARS関連コロナウイルスの構造遺伝子およびレプリカーゼ遺伝子を標的とするsiRNAの動態および相乗効果。 FEBSレター。 580、2414–2420 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao、H.ら。 SARS-CoV-2 オミクロン変異体は、TMPRSS2 発現細胞においてデルタ変異体と比較した場合、複製および融合活性の効率が低いことを示します。出現。微生物が感染します。 11、277–283 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バーキュレク、AC et al. デノボ合成に基づく SARS-CoV-2 レプリコン構築のためのスケーラブルなパイプライン。 bioRxiv 2022.02.05.478644 https://doi.org/10.1101/2022.02.05.478644 (2022)。

WRベッカーら。ハイスループット分析により、AGO2 による標的 RNA の結合と切断の規則が明らかになりました。モル。セル 75、741–755.e11 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ロイ、C.ら。世界の SARS-CoV-2 ゲノムにわたる変異蓄積の傾向: 新型コロナウイルスの進化への影響。ゲノミクス 112、5331–5342 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

チェン、P.ら。新型コロナウイルス感染症外来患者における SARS-CoV-2 中和抗体 LY-CoV555。Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 384、229–237 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ローゼンケ、K.ら。シリアンハムスターをSARS-CoV-2感染の感受性の高い前臨床モデルとして定義する。出現。微生物が感染します。 9、2673–2684 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チャン、JF-W. 他。ゴールデンシリアンハムスターモデルにおけるコロナウイルス感染症2019（COVID-19）の臨床病理学的症状のシミュレーション：疾患の病因と伝染性への影響。クリン。感染する。ディス。 71、2428–2446 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ユアン、L.ら。性別は、シリアンハムスターの SARS-CoV-2 の感染に対する感受性と病因の両方に関連しています。信号伝達。ターゲットサー。 6、136（2021）。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Senturk, S. et al. 条件付き Cas9 安定化に基づいて遺伝子編集を一時的に制御する、迅速かつ調整可能な方法。ナット。共通。 8、1–10 (2017)。

記事 Google Scholar

バーンスタイン、E.ら。ダイサーはマウスの発生に不可欠です。ナット。ジュネット。 35、215–217 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Reed, LJ & Muench, H. 50 パーセントのエンドポイントを推定するための簡単な方法。（1938年）。

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この研究は、ビル＆メリンダ・ゲイツ財団と国立衛生研究所の学内プログラムから一部資金提供を受けました。本書に含まれる調査結果と結論は著者のものであり、必ずしもビル & メリンダゲイツ財団の立場や方針を反映しているわけではありません。この研究の一部は、VRC/NIAID とイレブンセラピューティクスの間で CRADA 2020-0597 に基づいて実施されました。研究の一部は、Wellcome Trust から IG への研究助成金によって資金提供されました。 207498/Z/17/Z および MRC/UKRI G2P-UK National Virology consortium、参照番号 MR/W005611/1。 IG はウェルカムトラストシニアフェローです。

これらの著者は同様に貢献しました: Ohad Yogev、Omer Weissbrod、Giorgia Battistoni、Dario Bressan。

イレブンセラピューティクス、ケンブリッジ、イギリス

オハド・ヨゲフ、ジョルジア・バッティストーニ、ダリオ・ブレッサン、アディ・ナーマティ、イラリア・ファルチャトリ、アーメット・カン・ベルキュレク

イレブン・セラピューティクス、テルアビブ、イスラエル

オマー・ヴァイスブロート、ロニ・ラズニック、ショール・イラン、ヤニフ・エルリッヒ

CRUK ケンブリッジ研究所、ケンブリッジ大学、李嘉誠センター、ケンブリッジ、イギリス

ジョルジア・バッティストーニ、ダリオ・ブレッサン、グレゴリー・ジェームス・ハノン

ケンブリッジ大学、病理学教室、ウイルス学部門、ケンブリッジ、英国

リス・イズアグベ、マイラ・ホスミロ、イアン・グッドフェロー

イレブン・セラピューティクス、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

アイリス・グロスマン

ワクチン研究センター、国立アレルギー感染症研究所、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国

ローレン・マコーミック、クリストファー・コール・ハニーカット、ティモシー・ジョンストン、マシュー・ガニエ、ダニエル・C・ドゥエク

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OY と YE は GB、DB、OW、MGOY からの意見をもとにこの文書を執筆し、YE と OW は図と表の草案を作成しました。 OY、GB、DB、AN、IF、および ACB はインビトロ実験を実施しました。 RI、MH、IGG は生きたウイルス実験を続行し、統計分析を実施しました。 LM、TJ、CCH、MG は in vivo 研究を続けた。 YE、OW、および RR はシーケンスデータの解析を実行し、統計解析を実行しました。 YE、SI、IG、DD、GJH はディスカッションと研究デザインに貢献しました。

オハド・ヨゲブへの通信。

OY、OW、AN、IF、ACB、RR、SI、IG、および YE は、イレブンセラピューティクスの従業員です。 GJH は Scientific の共同創設者であり、イレブンセラピューティクスの株式を保有しています。 GB と DB は、イレブンセラピューティクスの株式を保有しています。この研究が行われたとき、IGはイレブン・セラピューティクス社のアドバイザーを務めていました。

すべての in vivo 研究は、実験動物の人道的管理および使用に関する NIH の規制および基準、ならびに NIH ワクチン研究センターおよび BIOQUAL, Inc. (メリーランド州ロックビル) の動物管理および使用委員会に従って実施されました。すべての研究は BIOQUAL, Inc. で実施されました。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Zhijuan Qiu。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Yogev, O.、Weissbrod, O.、Battistoni, G. 他 SARS-CoV-2 に対する RNAi 分子のゲノムワイドなスクリーニングから、検証された広域スペクトルの強力な予防法まで。 Commun Biol 6、277 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04589-5

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受信日: 2022 年 10 月 29 日

受理日: 2023 年 2 月 13 日

公開日: 2023 年 3 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04589-5

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