細菌の mRNA 翻訳と分解に関するアトラス - 佛山鉱業研究所グループ有限公司

Nature Microbiology volume 8、pages 1123–1136 (2023)この記事を引用

8233 アクセス

150 オルトメトリック

メトリクスの詳細

メッセンジャー RNA の安定性の調節は、細菌におけるプログラムされた遺伝子発現にとって極めて重要であり、無数の分子機構によって達成されます。 5' モノリン酸化 mRNA 分解中間体 (5'P) のバルク配列決定により、翻訳と同時に行われる mRNA 分解がグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方で保存されていることを示します。我々は、5'-3' エキソヌクレアーゼを持つ種では、エキソリボヌクレアーゼ RNase J が後続のリボソームを追跡して、リボソームの 5' 位置の in vivo 単一ヌクレオチドトープリントを生成することを実証します。 5'-3' エキソヌクレアーゼを欠く他の種では、リボソームの位置によってエンドヌクレオチド切断部位が変化します。メタデグラドーム (5'P デグラドーム) 配列決定アプローチを使用して、枯草菌、大腸菌、シネコシスティス属を含む 96 種の 5'P mRNA 分解中間体を特徴付けます。および Prevotella copri を解析し、ストレスや薬物治療に対するコドンレベルおよび遺伝子レベルのリボソーム失速反応を特定します。また、5'P シークエンシングを複雑な臨床および環境マイクロバイオームに適用し、メタデグラドームシークエンシングにより、薬物または環境の摂動に対する応答の種特異的な転写後の特性評価が迅速に得られることを実証します。最後に、細菌における RNA 分解のメカニズムの分析を可能にするために、96 種のデグラドームアトラスを作成しました。私たちの研究は、培養不可能な種や複雑な微生物群集における転写後制御の研究へのメタデグラドーム配列決定の応用への道を切り開きます。

メッセンジャー RNA (mRNA) の分解と翻訳は密接に関連しており、リボソーム動態の変化はメッセンジャー RNA の安定性を直接調節します 1、2、3、4。真核生物では、タンパク質合成と mRNA 分解は、最後の翻訳リボソームに続いてその位置の in vivo トープリントを生成する 5'-3' エキソヌクレアーゼ Xrn1 によって結びついています 5,6。細菌における RNA 分解により、変化する環境への適応が可能になりますが、細菌における RNA 分解についての理解は、RNA 分解機構の多様性によって妨げられてきました。細菌の RNA 分解は、エンドヌクレオチド切断による切断とそれに続く 3'-5' 分解によって開始されると考えられていました 7、8、9、10。 Bacillus subtilis 11 および他の種のそのホモログにおける RNase J の 5'-3' RNA エキソヌクレオチド分解活性が報告されており、翻訳効率が細菌の mRNA 安定性を調節することが知られています 3,12 が、翻訳と同時に行われる mRNA 分解が細菌の構造をどのように形成するのかはわかっていません。デグラドーム、あるいはこのプロセスが多様な mRNA 分解機構を持つ種によって異なるのかどうか。

細菌における RNA 生物学の制御をより深く理解するために、最適化された 5' モノリン酸化 (5'P) mRNA 分解中間体 (デグラドーム) シーケンス (5PSeq) を使用して、参照細菌株と複雑なマイクロバイオームにおける mRNA 分解を調査しました。私たちは、天然に存在する 5'P が in vivo リボソーム動態をどの程度反映するかを調査し、参照菌株および複雑な糞便培養物における環境ストレスや薬物治療に応答した 5'P デグラドームの特徴を調べました。私たちは、モデル生物B. subtilisを含む96の培養可能および培養不可能な種のmRNA分解パターンを分析し、その結果をここに報告します。

我々は、最適化された 5PSeq)5、13、14、15 (補足表 1 および 2 および方法) を使用して、個々の種および複雑な細菌群集における 5'P mRNA デグラドームを分析しました。まず、5'-3' 崩壊を持つ種のオープンリーディングフレーム (ORF) の 5'P デグラドームを調査しました。 B. subtilis は 5'-3' エキソヌクレアーゼ RNase J11 をコードします。 RNase J は真核生物の XRN1 と相同ではありませんが、酵母の XRN1 と同様に、その 5'-3' エキソヌクレアーゼ活性を介して、翻訳と同時に崩壊する mRNA 内の最後の翻訳リボソームを「追跡」できるのではないかと我々は仮説を立てました 5,16。我々の分析により、メタジーンレベルと単一遺伝子レベルの両方で、5'Pカウントの3ヌクレオチド（nt）周期性（図1a）と、各コドン（F1）の2番目のヌクレオチドに対する5'P優先性が明らかになりました（図1a）および拡張データ図 1a)。 5'P 分解中間体は、開始および終了が遅いリボソームから予想されるように、翻訳開始部位と停止部位のそれぞれ 11 および 14 nt 上流に蓄積します。このパターンは、出芽酵母の開始から -14 nt、停止から -17 nt の部位に類似しています5,15。この 3 nt 小さい保護サイズは、真核生物と細菌の間のリボソームサイズの既知の違いによって説明できます 17。我々は、ショ糖密度勾配のポリリボソーム画分に5PSeqを適用することによって、5'P崩壊中間体と翻訳リボソームとの関連を確認し、同様のパターンを観察した（拡張データ図1b）。その生物学的起源を証明するために、同じ RNA の in vitro 断片化により、in vivo で観察された 3 nt 周期性が 99.5% 以上 (高速フーリエ変換 (FFT) シグナルが 0.11 に低下)、および開始/停止に関連する足跡によって除去されたことを確認しました (図.1a)。最後に、このプロセスに RNase J の役割があるかどうかを調べるために、B. subtilis RNase JA 欠失 (rnjA) 株で分析を繰り返しました。これにより、RNase JA活性が、翻訳共生mRNA分解から生じる観察された5'P分布パターンを支えていることが明らかになりました（図1b）。

a、枯草菌由来のORFの翻訳開始部位および翻訳終結部位に対する5'マッピング位置のメタカウント（100万あたりの5PSeqリード数（RPM））。無処理 (NT) コントロール (緑色)、CAM 処理済み (黄色)、およびランダムに断片化されたコントロール (赤色) が示されています。同定された RNase は右上隅で強調表示されます (未同定のものは明るい灰色で表示されます)。元の 5PSeq 位置が報告されます (P サイト補正は適用されていません)。観察された周期性の FFT と、すべてのコドンの相対的な 5PSeq フレーム保護を示すヒストグラムも示されています。 b、aと同様、ΔrnjA株の5'Pメタカウント。 c、バシロタ門、シアノバクテリア門、シュードモナドータ門およびバクテロイド門門の代表的な種の5'P部位および±4塩基での切断モチーフの優先性。Rパッケージggseqlogo64で実装されているヌクレオチド寄与のシャノンエントロピーベースの測定を使用して計算されます。右側、各種で同定された RNase の存在が強調表示されています。 RNE/G (リボヌクレアーゼ E/G ファミリータンパク質) は、両方のリボヌクレアーゼ間に保存された触媒ドメインの存在を示します。 EPA、リボソーム上の tRNA 結合部位 E、P、および A。

次に、mRNA 分解における他のヌクレアーゼの役割を評価するために、ゲノムに注釈が付けられた 5'-3' RNA エキソヌクレアーゼの有無を調べた (拡張データ図 2)9。まず、バチルス菌（バチルス・アミロケファシエンス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ）、シアノバクテリア（シネコシスティス種PCC 6803）、シュードモナドータ（カウロバクター・クレセントゥス）をテストしました。これらはすべてRNase Jをコードしています。全長に沿って明確な3ntの周期パターンが観察されました。 B. subtilis で観察されたように、5'P リードが各コドンの 2 番目のヌクレオチド (F1) と開始コドンと終止コドンのそれぞれ 11 nt および 14 nt 上流に頻繁に蓄積するコード領域 (拡張データ図 2) (図 2) .1a)。興味深いことに、Synechocystis sp. PCC 6803 では、リボソーム保護パターンが 1 ヌクレオチド余分に置き換えられました (つまり、開始コドンから -12 nt、終止コドンから -15 nt に蓄積) (拡張データ図 2d)。これは、リボソームの保護サイズや構造の違い、または潜在的な補因子の存在によって説明される可能性があります 18、19。また、大腸菌 (DH5α および MG1655) を含むシュードモナドータ属および嫌気性バクテロイドータ属 (Alistipesfinegoldii、Prevotella copri、Prevotella timonensis、および Parabacteroides merdae) もテストしましたが、いずれも 5'-3' エキソヌクレアーゼ活性を持っていません。我々は、RNE/G タンパク質ファミリー (RNE/G) ホモログ 20 と RNase Y を有する研究対象のバクテロイドタ属で 3 nt の周期性パターンを観察しました。 RNase Y ではなく RNase E を有する大腸菌では、わずかな 3 nt の周期性を観察しました。 (拡張データ図2f)、これはMG1655株ではあまり目立たず、コード領域に蓄積する5'Pリードが少なくなりました(拡張データ図2g)。 5'-3' エキソヌクレアーゼを持つ種とは対照的に、RNase J を欠く種は開始コドンと終止コドンの周囲に 5'P エンドヌクレオチド分解部位を蓄積します。さらに、ほとんどの種で 5'P 切断が開始コドン自体と重複しており、11 nt 上流で予想されるリボソーム保護とは異なることが観察されました。開始コドンに関連する切断は、C. crescentus で特に顕著でした。私たちは、翻訳開始と mRNA 分解の間には関係があり、エンドヌクレオチド切断が開始コドンで起こることが多いと考えています (拡張データ図 2)。

真核生物で報告されているように、観察された 3 nt の周期性は、生体内でのリボソーム位置の 5'-3' 単一ヌクレオチドのトープリンティングに由来している可能性があります 5。あるいは、それは、エンドヌクレアーゼ特異的な切断優先性、mRNA へのアクセス性の違い、およびコード領域に沿ったヌクレオチドの非ランダム分布の間の相互作用の結果である可能性があります。以前の研究では、選択された種におけるRNase E21、22およびRNase Y23、24の配列優先性を調査したため、カバーされる種の範囲を拡大するために、異なるRNA分解機構を持つ多様な種のセットを含めることを選択しました（図1c）。 Synechocystis sp.25 および C. crescentus における Y を持たない RNase J および E の存在は、U が前に付く A を優先する 5'P mRNA 分解中間体と関連しています (-1 U/+1 A)。 Bacteroidota における RNase Y および RNE/G タンパク質相同体の存在は、+1 A を好むことを示唆しています。5'-3' エキソヌクレオチド分解活性が支配的な Bacillota では、5'P mRNA 分解中間体はより均一な配列モチーフを示します。 RNase J がエンドヌクレアーゼによって生成された切断部位をトリミングする可能性があります。この仮説と一致して、エンドヌクレアーゼRNase YがRNA分解の主なドライバーであるバクテロイドータと同様に、B. subtilis rnjA欠失変異体ではAに対する5'P優先性が現れます（拡張データ図3a）（図1c）26。、27。 B. subtilis における RNase JB (rnjB) および RNase Y (rny) 欠失の影響をテストしたところ、観察されたパターンへのそれらの寄与は最小限であることがわかりました (拡張データ図 3a)。興味深いことに、ヒートショック（HS）後に同じ分析を実行すると、すべてのサンプルで +1 G 優先度の明らかな増加が観察されました（拡張データ図 3b）。これは、RNase とリボソームの位置の間の相互作用が動的であり、環境の課題に応じて変化する可能性があることを示唆しています。また、化膿連鎖球菌 rnjA の異種発現が大腸菌で観察されるエンドヌクレオチド分解パターンを変化させるのに十分であるかどうかもテストしました。しかし、5PSeqで測定したmRNAレベルでrnjAが発現した場合でも、パターン（-1 U/+1 A/+3 G）は維持され（拡張データ図3c）、RNase E活性が依然としてmRNA分解を支配していることが示唆されました。観察されたパターンが生物学的メカニズムによって引き起こされていることを確認するために、B. subtilis および E. coli のサンプルにおける in vitro RNA 断片化後の 5'P 優先性の喪失を実証します（拡張データ図 3a、c）。我々は、天然に存在する 5'P mRNA 分解中間体の配列優先性は系統発生的に関連した種全体で保存されており、RNA 分解経路間のクロストークによって形成されると結論付けています。

リボソームが 5'P 分布にどのような影響を与えるかを調査するために、クロラムフェニコール (CAM) を使用してリボソームのダイナミクスを乱しました。リボソームが伸長で停止すると、B. subtilis、L. plantarum、L. reuteri、B. amyloliquefaciens で 3 nt リボソーム保護パターンの増加が観察されました (図 1a および拡張データ図 2a、c)。また、ORF の 5' 領域周辺で相対的に過剰な 5'P 分解中間体と 3' 領域周辺での保護の減少も観察され、これは開始または終結ではなく翻訳伸長の特異的阻害と一致しています 17。 ORF の 5' 領域における 5'P の蓄積は、5'-3' エキソヌクレアーゼ活性を持たない種でも明らかであり、エンドヌクレオチド分解活性がリボソームの位置に関する単一ヌクレオチド分解能の情報を提供するとは期待できません（拡張データ図 2f- k)。我々の結果は、CAM処理後のリボソームの停止がエンドヌクレアーゼの生体内でのアクセスを制限し、5'P mRNAデグラドームに影響を与える可能性があることを示唆しています。次に、豊富な 5'P mRNA 分解中間体が、RNase J を含む種におけるコドン特異的なリボソーム停止の代理として機能するかどうかを検討しました。5'P リードをそれぞれのアミノ酸にアラインメントすることにより、アミノ酸特異的なメタジーンを生成しました。プロファイル (図 2 および拡張データ図 4)。 L. plantarum では、これは停止点の遅いリボソームと Cys コドンに関連する明らかな 5'P 蓄積を示し、おそらく増殖培地中の遊離 Cys の利用制限に関連しています (図 2a)28,29。次に、翻訳プロセスを混乱させ、5'P 蓄積に対する影響をテストしました。まず、Ile tRNA シンテターゼを標的とする抗生物質であるムピロシン (MUP) で 10 分間処理した後、コドン特異的休止を検出する能力をテストしました。 MUP処理により、Ileコドンでのリボソームの停止と、L. plantarum、L. reuteri、B. subtilisの14nt上流に5'Pリードの明確な蓄積が生じました（Aサイトの停止、図2aおよび拡張データ図4a））。これは、リボソームの位置が細菌のデグラドームを形成していることを示唆しています。次に、B. subtillis、L. plantarum、L. reuteri、B. amyloliquefaciens における 5 分間の CAM 処理に関連するコドン特異的一時停止を調査しました (図 2a、b および拡張データ図 4b)。翻訳伸長の一般的な阻害に加えて、CAM はリボソームの状況特異的な蓄積も引き起こします 30,31。すなわち、大腸菌のCAM処理は、Ala（および頻度は低いがSer、Thr、またはGly）がE部位に位置する場合にリボソームの失速を増加させることが以前に報告されている。 5PSeqを使用して、RNase Jを使用して、試験種のAlaおよびSerの8nt上流でCAM誘導性リボソームが停止していることも特定しました（図2a、bおよび拡張データ図4b）。我々は、CAM処理後の状況特異的リボソームストールは細菌内で保存されていると結論づけた。さらに、我々の結果は、5'P シグネチャーが、RNase J を持つ種の翻訳プロセスを標的とする抗生物質の分子レポーターとして使用できることを示しています。

a～c、アミノ酸特異的 5'P RNA カバレッジのヒートマップ。青 (低) から黄色 (高) に色分けされています。特定のアミノ酸からの距離を塩基数で示します。 –14 で停止したリボソームは、A サイトの停止を示します。選択したアミノ酸は折れ線グラフとしても表示されます。 a、OD600 = 0.6 ～ 0.8 (OD = 0.6) で収集された NT 対照サンプルと比較して、CAM (黄色) および MUP (紫) 処理後に L. plantarum は停止します。 b、B. subtilis の状況特異的な CAM の停止は、-8 位にある（ペプチド鎖の）最後から 2 番目のアミノ酸によって誘導されます（CAM、黄色）。 c、L. plantarumはストレス治療後に活動を停止します。 d、e、リボソーム保護表現型のPCA（方法）は、L. plantarum（d）およびB. subtilis（e）におけるストレスと薬物治療を区別します。未処理のB. subtilis の別々のクラスターは、収穫時の成長段階の違いによって説明できます (OD600 はそれぞれ 0.2 ～ 0.3 および 0.6 ～ 0.8)。

次に、B. subtillis、L. plantarum、およびL. reuteriにおけるストレス条件下での5'P RNA分解プロファイルを研究しました（図2cおよび拡張データ図4）。熱ショックおよび低栄養（LNUT）条件下ではL. plantarumのTyrコドンで、また定常増殖ではHisおよびArgコドンで明確なリボソームの停止を確認しました（STAT;図2c）。 5P-seq は、すべてのアミノ酸位置における 5'P 分解中間体のリボソーム依存性蓄積の概要を提供し、これらのデータを使用して、各サンプルの一般的なアミノ酸特異的な「リボソーム保護表現型」を生成しました (方法)。この表現型を主成分分析（PCA）と組み合わせることで、L. plantarumの対照サンプル、ストレス処理サンプル、および薬物処理サンプルを分離することができました（図2d）。同様に、同じ戦略により、薬物治療、ストレス条件、および枯草菌の定常期の経時的測定（24時間、48時間および8日）が分離されます（図2e）。したがって、コドン特異的リボソーム保護表現型を利用して、薬物治療と他のストレス状態を区別することができます。環境変化に応答したコドン特異的なリボソームのストールを分析するために、リボソームAサイトのストールに関連する5'Pリードに焦点を当てました（拡張データ図4c、d）。 L. plantarum での熱ショックの後、Gln コドンの 5'P カバレッジがより高いことがわかり、コドン特異的なリボソームの停止が示唆されました。定常増殖では、Arg コドン（CGG、CGA、AGG および AGA、ただし CGG および CGU ほどではない）はリボソームの失速と関連していました（拡張データ図 4e）。興味深いのは、同じ戦略を枯草菌に適用した場合です。（拡張データ図4d）熱ショックは、Glnコドン（CAAおよびCAG）でのリボソームの失速、およびArgコドン（CGC）での失速を伴う定常成長にも関連していることが観察されました（拡張データ図4f）。これは、環境負荷が同様のコドン特異的リボソームの停止を引き起こす可能性があることを示唆しており、これは tRNA プロセシングおよび生合成のストレス特異的欠陥 32,33 またはアミノ酸プールの変化 29,34,35 のいずれかが原因である可能性があります。

5PSeq は、グローバルパターンに加えて、遺伝子固有のリボソームストールに関する情報も提供します。遺伝子全体にわたる 3 nt 保護パターンの相対的な強度を測定しました (遺伝子特異的フレーム保護インデックス (FPI)、方法)。これは、各遺伝子の mRNA 量とは無関係に、最後の翻訳リボソームの相対的な失速の尺度を提供します (つまり、mRNA 配列に沿ったピークと谷を比較します)。薬物治療およびストレス治療は、細菌反応に関与する個々の遺伝子のFPIの変化を誘発します（拡張データ図5および補足表3）。たとえば、熱ショックは、胞子壁に関連する mRNA の FPI の増加（より高い 3 nt 周期）を引き起こし（誤検出率（FDR）< 0.022）、また酸化還元酵素活性を伴う塩ストレス（FDR < 0.011）も引き起こします。定常増殖中、胞子壁に関連する遺伝子のFPIは増加しました（FDR < 2.2 × 10-16）が、Lys生合成およびリボソームRNAプロセシングに関与する遺伝子のFPIは減少しました（それぞれFDR < 0.024および< 0.044）。興味深いことに、CAM または MUP に曝露されると、リボソームタンパク質遺伝子の相対 FPI は明らかに減少し (FDR < 2.2 × 10-16)、これは薬物に応答したトランスクリプトームの残りの部分に対するリボソーム保護の相対的な変化を示唆しています。これらの発見は、5P-seq がストレス中のリボソームの位置と翻訳制御について遺伝子特異的レベルでも情報を提供し、薬物治療に対する迅速な表現型の翻訳応答を検出できることを示しています。

mRNA 分解中間体の相対存在量の定量は、5PSeq を使用して実行できます。私たちは、異なる摂動を使用して、複数の種においてデグラドームがどのように全体的に変化するかを調査しました。まず、ゲノム全体にわたる 5'P RNA 分子の存在量を調査しました (拡張データ図 6a)。 B. subtilis 染色体全体の 5'P RNA 分布は、試験したすべての RNase 変異体で比較的安定していましたが、熱ショック後に遺伝子内領域に由来する RNA の増加が観察されました。大腸菌では、5'P RNA 分子が DH5α のコード領域と優先的に関連し、MG1655 の 5' 非翻訳領域 (UTR) と優先的に関連する株間の違いが観察され、これはコード領域周囲の 5'P RNA で観察された違いと一致しています。 (拡張データ図2)。また、大腸菌の遺伝子間領域からの 5'P RNA の増加も観察されました。次に、各成熟 RNA の存在量と分解の可能性を統合する尺度である、単一遺伝子レベルでの 5'P 分解中間体の変動を調査しました (拡張データ図 6 および補足表 3)。我々は、B. subtilis における 5'P mRNA フラグメントの遺伝子特異的存在量を定量化し、熱ショックにより胞子発芽遺伝子 (FDR < 7.68 × 10-4)、塩ストレスおよび His 生合成 (FDR < 2.2 × 10-4) の分解中間体が増加することを示しました。 –16)。定常的な増殖により、B. subtilis と L. plantarum の両方で翻訳に関連する 5'P mRNA フラグメントが減少しました (FDR < 2.2 × 10-16)。大腸菌では、熱ショックにより翻訳に関連する分解中間体が減少し（FDR < 2.2 × 10-16）、グルコース異化に関連する分解中間体が増加しました（FDR < 0.016）。次に、B. subtilis の特定の RNase が遺伝子特異的な 5'P mRNA デグラドーム断片の存在量にどのような影響を与えるかを調べました。我々のメタジーン分析と一致して、遺伝子特異的な豊富なmRNA分解中間体のPCAにおいて、rnjA欠失は野生型株とrnjBおよびrnY欠失変異体から分離されました（拡張データ図6bおよび補足表4）。また、翻訳に関連する分解中間体の減少も観察されました（FDR < 2.2 × 10-16）（補足表3）。 rnjB 欠失はホスホエノールピルビン酸依存性糖ホスホトランスフェラーゼ系に関連する分解中間体の減少をもたらし（FDR < 2.2 × 10-16）、rny 欠失は走化性に関連する分解中間体の減少をもたらしました（FDR < 2.2 × 10-16）。

RNase の調節機能を特徴付けるために、RNase の枯渇が調節 RNA および 5' UTR の量に及ぼす影響を調査しました (拡張データ図 6c、d および補足表 4)。 rnjA 欠失により、ヒスチジル tRNA 合成酵素 5' UTR (FDR < 8.86 × 10-7)、Ser tRNA リガーゼに特異的な T-box リボスイッチ (FDR < 3.18 × 10-7)、および低分子調節 RNA roxS ( FDR < 7.9 × 10–4）、とりわけ（詳細および他のRNaseについては拡張データ図6c、dおよび補足表4を参照）。興味深いことに、コード領域の範囲に加えて、枯草菌および大腸菌の転写開始部位と重複する5'Pピークも特定しました（拡張データ図6e、f）。

5PSeq が細菌内のリボソームの動態をマッピングすることを示したので、次にそれを混合サンプルに適用しました。ヒトのマイクロバイオームは健康と病気に役割を果たしています 36,37 が、マイクロバイオームの転写後制御に関する我々の理解は限られています。ポリリボソーム分画とそれに続く in vitro リボソームフットプリンティングと配列決定に基づくリボソームプロファイリングは、リボソーム位置のマッピングに使用されています 19 が、マイクロバイオームへの応用は技術的に困難であり 38、in vitro RNA 消化後のリボソーム保護フラグメントのサイズが小さいため制限されます (~23 -24 nt)17,39。デグラドーム配列決定には、潜在的な利点が含まれます。(1) より長い、in vivo で生成されたリボソーム保護フラグメントにより、サンプル中の密接に関連した種の解決が可能になる可能性があります (拡張データ図 7a)。 (2) 細胞内分画40の必要がない単純さ。 (3) 保存された RNA サンプルに適用できる 5,41。 (4) 細菌種の約 60% に相当すると推定される RNase J を含む種における生体内リボソームの位置、コドン特異的リボソームストール、およびアミノ酸制限に関する情報を提供します9。

細菌群集への 5PSeq の適用可能性を実証するために、我々はまず、2 つの密接に関連した種、L. ロイテリと L. プランタルムの混合物における 5'P mRNA 分解中間体を分析しました。 MUP処理したL. plantarumと未処理のL. reuteriからの異なる量のRNAをプールしました（1：1〜1：10,000、図3a）。 MUP に関連する Ile リボソームの停止は、1:10,000 の比率 (存在量 0.01%) でも検出できます。この制限はシーケンスの深さによって決定されます (つまり、1:10,000 ミックスでは 82 リードのみが L. plantarum コード配列にマッピングされました)。種特異的な摂動を検出する能力を確認したので、次に、定義された微生物群集標準におけるリボソーム動態を調査しました（拡張データ図7b）。次に、臨床および環境のマイクロバイオームサンプルを調査し、以前に分離された RNA サンプルを使用して膣マイクロバイオームのメタデグラドームを研究しました42。種の存在量のRNAベースの指標に加えて、ほとんどの同定された種の分解プロファイルも取得しました（図3b）。これらのデータにより、種や患者全体での in vivo リボソーム保護表現型の調査が可能になりました。最後に、私たちの方法をより複雑なマイクロバイオーム（ヒトの糞便マイクロバイオームと堆肥、拡張データ図7c、d）に適用しました。

a、異なる比率（1:1〜1:10,000、L. plantarum対L.reuteri）で混合したL.ロイテリ（水色）とL.プランタルム（紫）のIleコドンに関する5P|Seqメタ遺伝子存在量を示す線プロット）。 L. plantarum の MUP 処理 (下) は、L. reuteri NT 対照と比較して明確な Ile 休止をもたらしました。 L. plantarum と L. reuteri は、コード領域間で 63 ～ 80% のゲノム類似性を持っています。 b、以前に分離された膣マイクロバイオームの5PSeq分析。各種および健康なドナーに割り当てられたリード数は丸で示されています。図 1 に示す、相対フレーム保護と FFT、および選択された RNase の有無。

我々は、5P-seq は mRNA 存在量の変化とは無関係に、薬物治療に対する種特異的な転写後反応を検出できる可能性があると推論しました。私たちは、翻訳を標的とした薬物に応答した、バシロタ属とバクテロイドータ属に富む複雑な糞便マイクロバイオーム培養物のメタデグラドームを分析しました（図4および拡張データ図8a）。 CAM、MUP、ドキシサイクリン（DOX、翻訳伸長の阻害）およびエリスロマイシン（ERY、アミノアシル転座の阻害）を使用しました。まず、メタデグラドーム配列決定により高い分解能が得られるバシロタ属 (RNase J を含む) に焦点を当てました。分離種でのこれまでの分析から予想されたように、CAM と MUP の使用は、Enterococcus faecalis (桿菌綱)、Clostridium tyrobutiricum (Clostridia 綱)、Anaeroglobus geminatus (綱) などの桿菌属の Ile と Ala で状況特異的な失速を引き起こしました。 Negativicutes) (図 4a、b)。 DOX では、開始コドンから -11 nt の位置に明確な 5'P RNA の蓄積が観察され、リボソームの保護が開始レベルで停止していることを示しています（図 4c）。 ERY については、Lys (K) や Arg (R) などの正に荷電したアミノ酸に関連したリボソームの失速が観察されました。これは、以前の報告と一致して、モチーフ (R/K) × (R/K) (図 4d) および Pro (拡張データ図 8b) で特に発生しました 43、44、45、46。効果は治療後 5 分ほどで観察され、30 分後に最大の効果が現れました (図 4)。この応答の遅れは、糞便培養物の増殖速度が遅いこと、および翻訳応答の遅れと一致しています。興味深いことに、各薬物は混合培養中の細菌種に対してさまざまな影響を及ぼしており、細菌固有の生理学的状態と培養組成が細胞の翻訳混乱に対する応答能力を調節できることを示唆しています。たとえば、Enterococcus faecium46 は私たちの実験では薬物に反応しませんでした。 (拡張データ図 8c)。

a〜d、選択した特徴に関する 5PSeq メタ遺伝子の存在量を示す折れ線プロット。特定のアミノ酸からの距離はヌクレオチドの数で示されます。 3 つの異なるクラスの種の例 - E. バシロタ門由来のフェカリス（桿菌）、C. チロトリシン（クロストリジウム）、および A. ジェミナトゥス（ネガティビクテス）が紹介されています。 a、NT対照と比較した、5分後および30分後のMUPで処理したサンプルにおけるIleコドンに対する5'エンドポイントの分布。ｂ、ａと同様であるが、ＣＡＭ処理後のＡｌａコドンについては同様である。ｃ、ＤＯＸ処理後の開始コドンを除いてａと同様。ｄ、ＥＲＹで処理したサンプル中の（Ｒ／Ｋ）×（Ｒ／Ｋ）の形のＬｙｓ（Ｋ）およびＡｒｇ（Ｒ）に富むトリペプチドモチーフの最初のコドンを除いてａと同様。

私たちのマイクロバイオーム実験では、バシロタのリボソーム停止メカニズムの多様性も特定しました。クロストリジウム綱およびネガティビクテス綱の種（例えば、C. tyrobutiricum および日和見病原体 A. geminatus など）は、リボソームストールの 2 nt 上流に追加の保護サインを持っています（図 4）。これは試験したすべての薬剤で発生し、影響を受けたリボソームは伸長または開始のいずれかで停止しました。さらに、これは系統発生的に関連する種間で保存されており、これらの種の失速したリボソームが追加の補因子と相互作用するか、あるいは別の立体構造を提示して、生体内でのリボソーム保護パターンを変化させることが示唆されています。

最後に、5'-3' エキソヌクレアーゼ活性を欠くバクテロイドータ属およびシュードモナドータ属の種のメタデグラドームプロファイルに対する抗生物質処理の効果をテストしました。示差的なリボソームの停止に関する単一ヌクレオチドの情報は期待していませんでしたが、バクテロイデスユニフォミスとバクテロイデスフラジリスの CAM と ERY、バクテロイデスシータイオタオーミクロンの DOX、および大腸菌におけるMUPおよびCAM（拡張データ図8d）。要約すると、我々は、メタデグラドーム配列決定により、複雑なマイクロバイオームサンプルにおける転写後制御に関する種特異的な情報を明らかにできることを示しました。

私たちの方法の用途の広さを示すために、細菌の生命系統樹全体の mRNA 分解のアトラスを作成しました (図 5)。 58属にわたる96種を分析し（図5および補足表5〜7）、mRNA分解パターンと分類学的分類の間の一致、およびほとんどの属での3nt周期性の存在を特定しました（図5、内側の棒グラフ）。バシロタ属 (緑色) などの RNase J を含む属は、フレーム F1 の 5'P を一般に優先する明確な 3 nt 周期性を持っています (たとえば、ラクトバチルス属、バチルス属、およびメガスファエラ属)。一方、RNase E および G ファミリータンパク質と RNase Y によるエンドヌクレオチド切断への依存性が高いバクテロイドータは、コドンの最後のヌクレオチド (F2; 図 5、ベージュ色) と頻繁に関連する 5'P 部位を示します。、例えば、パラバクテロイデス、アリスティペス、バクテロイデスなど。多くの種は、より複雑なコドン関連の 5'P パターンを持っています。たとえば、ウレアプラズマ (マイコプラズマトータ) とアッカーマンシア (ヴェルコミクロビア) は F1 と F2 に 5'P 部位を持ちますが、カウロバクター (シュードモナドータ) とプレボテラ (バクテロイドータ) は F1 と F0 に関連付けられています。 5'P の優先性とリボソーム保護の両方が、分類学だけでなく環境条件や薬物治療 19 にも影響を受ける可能性があることに注意することが重要です。我々がディープシーケンスカバレッジを作成したいくつかの種（図5、内側の灰色の円）、例えば大腸菌（ガンマプロテオバクテリア綱の代表）は、コドン位置に関して5'Pに対する明確な優先性を示さない。 5'P部位に対する配列優先性の以前の分析（図1c）と一致して、RNase Jを持つ種は5'P配列特異的優先性をほとんど示さないことが観察されました。 RNase G のエンドヌクレオチド分解活性への依存性が高い種は -1 U/+1 A を使用することが多いのに対し、RNase Y に依存する種では +1 A が明らかに豊富になっています。RNA 分解機構とリボソームの位置の間の相互作用をさらに詳しく調べるために、我々はMUP処理後のIleコドンでの停止したリボソームの保護（外側の紫色の円、図5）。バシロタ属に焦点を当てると、予想される保護サイズ (つまり、図 2 の 14 nt) に加えて、クロストリジウム属では –16 nt の保護が観察されました。これは、系統発生的に関連した種全体でのリボソームの停止に応答する分岐メカニズムを示しています。これらの結果は、翻訳の摂動と組み合わせた生体内での mRNA 分解の全体的な調査が、現在特徴づけられていない翻訳調節機構と抗生物質治療に対する種特異的応答の両方を発見する上で有用なツールであることを示しています。

調査された種の分類ツリー。円は内側から外側に、灰色 (割り当てられたリードの数)。赤 (3 nt の周期性の強さ)、フレーム優先 (F0、ベージュ、F1、緑、F2、水色)。属レベルのRNJA、RNY、およびRNE/GでのRNA分解に関与する選択された酵素の同定。 E/Gタンパク質ファミリーのリボヌクレアーゼ。 30分間のMUP処理後のIleコドン前の13～17ntの5'Pエンドポイントの蓄積。選択した種の 5'P エンドポイントの周囲に 4 nt の切断モチーフ (切断優先性のないバシロタ属はスキップします (図 1c))。全体として、膣スワブ、糞便、糞便培養物および堆肥を含む、培養細菌および複雑な環境からのサンプル中に 58 の属が存在しました。複雑なサンプルでは、コード領域に少なくとも 1,000 リード (堆肥の場合は 300) を持つ種が考慮され、それぞれの属が分析されました (方法)。

RNase 間の相互作用と細菌間の翻訳プロセスを調査するリソースの利用を容易にするために、さらなる調査のためのインタラクティブな閲覧可能な Web サイト (http://metadegradome.pelechanolab.com) を提供しています。

私たちは、最適化された 5PSeq 法を使用して、孤立した種および複雑なマイクロバイオームにおける mRNA 分解中間体を調査し、翻訳と同時に行われる mRNA 分解が細菌間で広く起こっていることを発見しました。 RNase J を含む種では、5'P mRNA 分解中間体が単一ヌクレオチドの分解能でリボソーム保護情報を提供しました。私たちのアプローチにより、薬物処理、細胞内分画、またはインビトロでの RNA 分解を必要とせずに、インビボでのコドンおよび遺伝子特異的なリボソームストールの研究が可能になります。我々は、最適化された5PSeqが、複数の種における環境によって引き起こされる翻訳制御を、コドンレベル（図2）と遺伝子特異的レベル（補足表3）の両方で検出できることを示します。 5'-3' エキソヌクレアーゼ活性を持たない種では、翻訳プロセスの混乱により、遺伝子に沿った 5'P の分布が変化しました。これは、これらの種では、リボソームの位置を一塩基の分解能でプリントできる 5'-3' エキソヌクレアーゼが欠如しているにもかかわらず、リボソームの位置の変化が同時翻訳 mRNA デグラドームも形成していることを示唆しています。我々は、細菌の翻訳共崩壊プロセスを利用して、5PSeq が、mRNA 存在量の変化とは無関係に、薬物処理による翻訳プロセスの混乱に対する迅速な転写後応答 (5 分以内) を検出できることを示しました。翻訳と同時に起こる mRNA の分解は広く見られますが、細菌種によって独特であるため、5PSeq シグネチャを適用して、摂動に対する種特異的な転写後応答を捕捉することができます。私たちの方法を採用することで、培養や細胞内分画を必要とせずに、翻訳の環境的または化学的調節の研究が可能になる可能性があることを提案します。最適化された方法を使用して、リボソームの位置が細菌デグラドームの境界と存在量を形成する鍵であることを示します。私たちは、tRNA の生合成やプロセシングにおけるストレス特異的な欠陥 32、またはアミノ酸利用可能性の変化 47 を引き起こす環境変化が、RNase J を含む種において予測可能な方法でデグラドームを変化させることを示しています。さらに、私たちの研究は、細菌のストリンジェントな反応が、制御に加えて、影響を及ぼしていることを示唆しています。転写と翻訳 35,48 も細菌のデグラドームを変化させます。また、リボソームの失速とそれに関連する翻訳共崩壊パターンがストレス条件全体で高度に制御されており、mRNA存在量の変化とは無関係に遺伝子特異的な変化を調査するために使用できることも示します。例えば、枯草菌における翻訳と胞子壁形成に関連する遺伝子の遺伝子特異的 3 nt 周期 (FPI) に明らかな変化が観察されました (拡張データ図 5)。 B. subtilis のデグラドームに対するさまざまな RNase の寄与を分析することにより、調節 5' UTR および低分子調節 RNA の遺伝子特異的調節 (補足表 4)、およびそれらの細菌リボスイッチとの相互作用も特定しました 49。この情報は、mRNA リーダーの調節要素の将来の分析、およびそれらの作用機序の分子的分析を促進するのに役立ちます。重要なのは、この原稿で実行されたメタデグラドーム分析は、RNaseの存在量が容易に推測できるさまざまな培養可能および培養不可能な種に直接適用できるため（補足表6）、非モデル細菌におけるRNA崩壊の分子解剖への道を開くことです。種。

最後に、5PSeq を複雑な臨床および環境マイクロバイオームに広く適用して、種特異的なメタデグラドームプロファイルを取得できることを示します。複雑な実験プロトコルや細菌培養の必要性を排除することで、研究者は、ヒトの細菌群集の半分以上を構成すると推定される培養不可能な細菌種のリボソーム保護表現型を分析できるようになります50。私たちのアプローチは、細菌群集内に存在量 0.01% の種であっても翻訳応答を検出でき、より長いリボソームトープリントを使用することで、単一種の解像度で複雑な細菌群集の分析を可能にします。現在のメタゲノムアプローチを補完するその有用性と能力を実証するために、抗生物質処理後の複雑な糞便培養物におけるリボソームの動態を特徴付けます。私たちの研究は、5PSeq が翻訳プロセスを標的とした抗生物質に対する迅速な転写後反応を容易に識別できることを示しています。これは、複雑な微生物サンプルにおけるコドン特異的変化を調査する我々の能力を裏付け、薬物に対する種特異的応答の分子レポーターとしてデグラドームシグネチャーを使用する道を開くものである。当社は、58 属にわたる 96 種の細菌 mRNA 分解のアトラスを提供しています。我々の結果は、原核生物にわたるmRNA分解機構の多様性を強調し、翻訳摂動と5'P mRNAデグラドームを組み合わせる有用性を実証する。我々は、5'P RNA配列決定（補足表4）と発現されたRNaseの測定（補足表7）を組み合わせることで、将来的にはメタデグラドームの研究により、より少ない領域での調節5'リーダーの機構的特徴付けが促進されることを期待しています。特徴がよくわかる種。

要約すると、細菌の生活樹全体にわたる mRNA 分解の解析により、メタデグラドームが薬物に対する反応、細胞内アミノ酸の利用可能性、環境反応などの種特異的な生理機能に関する貴重な情報をどのように提供するのかが明らかになりました。メタデグラドーム解析により、マイクロバイオームにおける転写後制御の特性評価が可能になり、微生物群集の生物学に光が当てられます。

一晩細菌培養物 (光学密度 1 (OD600 = 1) を超えない) を使用して、主培養物を開始 OD600 0.03 ～ 0.05 まで希釈しました。特に指示がない限り、培養物は対数期 (OD600 = 0.4 ～ 0.8) に達したら遠心分離によって収集しました。別段の記載がない限り、細菌培養物は、推奨増殖培地を使用して回転させながら 37 °C で増殖させました。具体的には、L. plantarum (ATCC 8014) および L. reuteri (DSM 17938) は、MRS ブロス (Sigma-Aldrich) で増殖させました。 . plantarum ストレス処理は次のように実行されました: 定常期培養物を接種後 27 時間増殖させ、OD600 = ~4.5 で収集しました。未処理の対照、熱ショックおよび低栄養素のサンプルを生成するために、生物学的複製培養物 (40 ml)対数増殖期中期 (OD600 = 0.3 ～ 0.6) まで増殖させ、分割し (未処理のコントロール用に 10 ml、熱ショック用に 15 ml、低栄養サンプル用に 15 ml)、遠心分離によって細胞を回収しました。すぐにRNA分析に移ります。ヒートショックの前に、細胞を予熱したMRSブロスに再懸濁し、サーモミキサー中で60℃で15分間インキュベートしました。低栄養細胞ペレットを５０ｍｌの０．５×ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ）で徹底的に洗浄し、遠心分離し、上清を完全に除去した。次に細胞を予熱した0.5×LB培地(Sigma)に再懸濁し、37℃で合計15分間のインキュベーション時間後に回収した。CBサブチルス(168trpC2)を2×YT(1.6%(wt/vol)トリプトン(Bacto))中で培養した。 1% (wt/vol) 酵母エキス (Bacto) および 0.5% (wt/vol) NaCl。長期増殖のために、接種後中間対数、24 時間、48 時間および 8 日後にサンプルを収集しました。塩ストレスは混合によって実行されました。等量の 2 M NaCl と中期対数増殖期増殖させた B. subtilis (OD600 = 0.5 ～ 0.6) を加え、室温で 10 分間インキュベートし、遠心分離によって回収します。 E. coli (Invitrogen、no. 18265-017) および B. amyloliquefaciens を LB 培地で対数増殖期まで増殖させ、その後培養物を分割して未処理対照およびランダム断片化対照用のサンプルを生成しました。 L. plantarum および L. reuteri の培養物を最終濃度 100 μg ml-1 で増殖させ、37 °C で 5 分間インキュベートし、その後追加の 100 μg ml-1 CAM5 を含む氷上で回収しました。中対数の L. plantarum および L. reuteri の MUP 処理 (最終濃度 65 μg ml-1) を、ペレットの遠心分離と急速冷凍の後、37 °C で 10 分間実行しました。 C. crescentus (NA1000 株) を、0.2% (wt/vol) ペプトン (Bacto) および 0.1% 酵母エキス (Bacto) を含む PYE 培地中で 30 °C で対数中間まで増殖させ、続いて遠心分離および急速冷凍しました。細胞ペレット。シネコシスティス PCC6083 株は、BG11 増殖培地中で 30 °C、光強度 30 µE、大気 CO2 1% で培養し、対数増殖期中期に収穫しました 51。大腸菌、枯草菌野生型、RNase ノックアウト株のヒートショック処理は次のように実施しました。大腸菌 (MG1655) 株は LB 培地中で 37 °C で対数増殖期後期 (0.6 ～ 0.8) まで増殖させました。 B. subtilis 野生型 (168trpC2)、rnjA、rnjB、および rny 欠失株 41,52 を LB (rnjA については 100 μg ml-1 スペクチノマイシン、rnjB および rny 欠失については 5 μg ml-1 カナマイシンを添加) 中で 37 °C で培養しました。菌株）から対数増殖期（0.2 ～ 0.3）まで。培養物を 2 つに分割し、細胞ペレットを遠心分離によって収集し、未処理の対照サンプルを直ちに急速冷凍しました。ヒートショックは、細胞を65℃に予熱したLB培地に再懸濁し、その後65℃で10分間インキュベートすることによって実施した。遠心分離によってサンプルを収集し、RNA 分析のためにエタノール/ドライアイス浴中で急速凍結させました。

大腸菌の抗生物質処理では、MG1655 株を 37 °C の LB で対数増殖期まで増殖させ、未処理の対照、MUP (65 μg ml-1) および CAM (100 μg ml-1) のサンプリングのために培養物を 3 つに分割しました。培養物を抗生物質とともに 37 °C で 10 分間インキュベートし、遠心分離によって回収し、RNA 分析のためにエタノール/ドライアイス浴で急速冷凍しました。

大腸菌におけるRNase Jの発現のために、上位10細胞を、化膿連鎖球菌由来のRNase JAコード配列を含むプラスミド(rnjAプロモーター+rnjAを有するプラスミドpEC622:pEC85(化膿連鎖球菌において相補的にRNase J1を発現(pEC85))で形質転換した。 A. ファインゴールドディ (DSM 17242)、P. コプリ (DSM 18205)、P. メルデー (DSM 19495) および P. ティモネシス (DSM 22865) の菌株は嫌気的に培養されました。 GAM ブロス (HyServe) 中で 24 時間培養しました。指示されている場合、種は MUP (65 μg ml-1) または CAM (100 μg ml-1) で 10 分間処理しました。インキュベーション後、1 ml のアリコートを取り出し、細胞を触媒的に処理しました。 RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) の添加により不活化され、遠心分離により回収されます。

メタデグラドームの動態に対する薬物の影響を監視するために、我々は、4 つの薬物に対して嫌気的に培養された 2 つのヒト腸内マイクロバイオームを経時的にスクリーニングしました。健康な患者から腸内微生物叢を収集し、40% グリセロールに再懸濁し、500 μl のアリコートを –80 °C で保存しました。 1 つのアリコートを使用して、酸素の非存在下、2.5 ～ 3.0% の水素の存在下、37 °C で MCDA ブロス中で 24 時間維持したスターター培養液 10 ml に接種しました。微生物群集が代謝的に活発な増殖期にあることを確認するために、実験開始の 24 時間前に、上記の嫌気条件下でスターター培養物を新鮮な MCDA 培地で 1:10 の比率で希釈し、総量を 30 ml にしました。しかし震えずに。抗生物質による治療のために、6 ml の糞便培養物を抗生物質なし、または CAM (80 μg ml-1)、MUP (650 μg ml-1)、DOX (5 μg ml-1) を添加した 15 ml Falcon チューブに移しました。または ERY (5 μg ml-1)。 5分、30分または48時間のインキュベーション後、1mlのアリコートを取り出し、RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen)の添加により増殖細胞を触媒的に不活化した(処理前のt0および処理後5分、30分および48時間)。遠心分離によって回収されます。各サンプルの反復数は補足表 2 にリストされています。

ＲＮＡの抽出（特に記載がない場合）は、参考文献に記載されているように実施した。 54に若干の変更を加えたもの。簡単に説明すると、細胞ペレットを等量のLET (25 mM Tris pH 8.0、100 mM LiCl、20 mM EDTA) および水飽和フェノール pH 6.6 (Thermo Fisher) に再懸濁しました。細胞を、酸で洗浄したガラスビーズ（Sigma-Aldrich）を用いて、MultiMixerで3分間ボルテックスすることにより溶解した。等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール pH 4.5 (25:24:1) およびヌクレアーゼフリー水の添加後、さらに 2 分間ボルテックスし、続いて遠心分離することで溶解を延長しました。得られた水相を、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）、続いてクロロホルムを使用する２段階で精製した。遠心分離後、きれいな水相を酢酸ナトリウム-エタノールで沈殿させた。 Lactobacillus混合物（図3a）の場合、L. plantarumから抽出した微生物RNA（未処理コントロールおよびMUP処理）を、5P-seqライブラリープロトコルのRNAライゲーションステップの前に、L.ロイテリから抽出したRNA（未処理）と異なる比率で混合しました。。 8 つの不活化細菌株からなる Microbial Community Standard (Zymobiomics、番号 D6300、ロット番号 ZRC 190633) の技術的複製は、75 ～ 125 μl の解凍細胞懸濁液から RNA を抽出することによって生成されました。膣スワブサンプルは、1,000 μl の DNA/RNA シールド (ZymoResearch) 中のビーズを使用して機械的に溶解され、溶解物は使用前に –80 °C で 2 か月間保存されました。ライセートを解凍し、250 μl を微生物 RNA の抽出に使用しました。健康なドナーからの糞便を収集し、40% グリセロールに入れて輸送しました。 RNA の技術的複製は上記の日に抽出されましたが、以下に挙げる小さな変更が加えられています。簡単に説明すると、500 μl の糞便/グリセロール懸濁液を、SDS (25 mM Tris pH 8.0、100 mM LiCl、20 mM EDTA、10% SDS) および水飽和フェノール pH 6.6 (Thermo Fisher) を含む等量の LET バッファーと混合しました。）。溶解はカーバイドビーズとボルテックスすることによって実行されました。等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール pH 4.5 (25:24:1) およびヌクレアーゼフリー水の添加後、継続時間を 10 分間に延長しました。その後のすべてのステップは上記のように実行されました。培養腸内微生物叢の経時変化実験からの RNA を、SDS (25 mM Tris pH 8.0、100 mM LiCl、20 mM EDTA、10% SDS) を含む LET バッファーに変更を加えて、記載どおりに抽出しました。メーカーのガイドラインで推奨されているように、RNeasy PowerSoil Total RNA Kit (Qiagen) を使用して、出発物質 (スウェーデン、Sundbyberg 製) 2 g で堆肥 RNA を抽出しました。 RNA の品質は、1.2% アガロースゲルに 1 μg の全 RNA をロードするか、RNA Nano 6000 チップ (Agilent Technologies) を使用して BioAnalyzer に 12 ng の全 RNA をロードすることによって評価しました。 5P-seq ライブラリーの調製前に、メーカーのガイドラインに従って Qubit RNA BR (Broad-Range) キット (Thermo Fisher Scientific) を使用して RNA を定量しました。

DNAの精製は、腸内微生物群集からの細胞をガラスビーズ(Sigma)で溶解し、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈殿と組み合わせて実施した。ワークフロープロトコルは上記の RNA 抽出手順と同一ですが、LET (25 mM Tris pH 8.0、100 mM LiCl、20 mM EDTA、10% SDS) を 10 mM Tris-HCl pH 8.0 に置き換え、フェノールに置き換えました。 /クロロホルム/イソアミルアルコール pH 4.5、UltraPure フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール pH 8.0 (Invitrogen)

ポリリボスム分別は、以前に記載されたように 55 、若干の変更を加えて実行されました。簡単に説明すると、B. subtilis (168trpC2) を LB 培地で対数増殖期中期まで 37 °C で培養し、100 μg ml-1 CAM を含む氷上で 5 分間遠心分離して回収しました。得られたペレットを 1 × TN (50 mM Tris/HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM DTT、100 μg ml-1 CAM および完全 EDTA フリープロテアーゼ阻害剤タブレット) にガラスビーズを使用して 2 分間ボルテックスしながら溶解しました。、続いて氷上で 5 分間インキュベートします。溶解およびインキュベーションを２回繰り返した。 4℃、1,500gで5分間の遠心分離によって細胞破片を除去し、上清を80％クッションを含む15〜50％ショ糖勾配にロードしました。 36,000 rpm で 90 分間超遠心分離した後、Abs254 をモニタリングして分画しました。続いて、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、ｐＨ４．５（２５：２４：１）およびヌクレアーゼフリー水を添加し、続いて２分間ボルテックスし、遠心分離することによって、スクロース画分からＲＮＡを抽出した。水相をクロロホルムの添加、ボルテックス、および遠心分離によってさらに洗浄し、得られた水相は酢酸ナトリウム/エタノールで沈殿した。

私たちの 5P-seq ライブラリーは、150 ～ 9,000 ng の全 RNA をインプットとして使用し、軽微な変更を加えて前述のとおりに調製しました 5,41。ランダムな断片化サンプル (ネガティブコントロール) を調製するために、DNA フリー RNA からリボソーム RNA を除去し、その後、断片化バッファー (40 mM トリス酢酸塩 pH 8.1、100 mM KOAc、30 mM MgOAc) 中で 80 °C で 5 分間インキュベートして断片化しました。。製造業者の推奨に従って、2 容量の RNACleanXP ビーズ (Beckman Coulter) を使用して反応物を精製しました。メーカーの推奨に従って、5 U の T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (NEB) を使用して遊離 5' OH 部位を再リン酸化し、37 °C で 60 分間インキュベートしました。再リン酸化された断片化 RNA を、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (24:25:1) を使用して精製し、続いて酢酸ナトリウム/エタノール沈殿を行いました。このステップ以降、ランダムに断片化されたライブラリと標準的な 5P-seq ライブラリの調製手順が統合されました 41。 RNA は、固有の分子識別子を含む rP5_RND または rP5_RNA オリゴ (補足表 1) のいずれかにライゲーションされました。リボソーム RNA は、細菌、酵母、およびヒトのサンプルに適した Ribozero rRNA 除去キット (Illumina) を使用して除去されました。 rRNAが枯渇したサンプルを、1.8容量のAmpureビーズ（Abcam）を使用して精製し、5×断片化緩衝液（200mMトリス酢酸塩、pH8.1、500mM KOAc、150mM MgOAc）中で5分間加熱（80℃）することによって断片化した。後続のサンプルは、プライミングにランダム六量体を使用して逆転写されました。得られた相補的 DNA をストレプトアビジンビーズ (M-280) に結合させ、Klenow Fragment (NEB) を使用して DNA 末端修復および DNA 断片の 5' 突出末端へのアデニンの充填の酵素反応を行いました。共通アダプター (P7-MPX) をライゲーションし、5P-seq ライブラリーを PCR (15 ～ 17 サイクル) で増幅し、1.8 容量の Ampure ビーズ (Abcam) を使用して精製し、Qubit (Thermo Fisher) で定量しました。ライブラリーのサイズはバイオアナライザーのトレースから推定されました。 5P-seq ライブラリーは、各サンプルを等量混合してプールし、その後 300 ～ 500 nt フラグメントを濃縮しました。

この原稿で説明されている研究中に、私たちの研究室は、補足表2に詳述されているように、サンプルのサブセットに適用される簡略化されたハイスループット5P-seq戦略を開発しました。この戦略によってコンパイルされたライブラリは、最近説明されたように生成されました15,56。簡単に言うと、DNA を含まない RNA を、固有の分子識別子を含む RNA オリゴと連結しました。ライゲーションされた RNA は、ランダム六量体とイルミナ互換領域を含むオリゴでプライミングすることにより逆転写されました。 NaOHの添加によりRNAを除去した。リボソーム RNA は、社内の rRNA DNA オリゴ除去ミックス (補足表 1) を cDNA に添加し、二本鎖特異的ヌクレアーゼ (DSN、Evrogen) 処理を実行することによって除去されました。 rRNA を除去した cDNA を PCR 増幅しました (15 ～ 17 サイクル)。 Ribozero Illumina (細菌および酵母用) を使用した rRNA の除去は、一本鎖 RNA ライゲーションステップの後に実行されました。リボソームが枯渇した RNA を精製し、上記のオリゴを使用して逆転写し、PCR で増幅しました。ライブラリーは蛍光 (Qubit、Thermo Fisher) によって定量され、そのサイズは Agilent Bioanalyser を使用して推定され、NextSeq500 または NextSeq2000 Illumina シーケンサーを使用して配列されました。

メーカーのガイドライン（ThruPlex DNA-Seq Kit、Takara Bio）に従って、未処理（t0）および48時間（t48h）処理した糞便培養の時点からDNAライブラリーを調製しました。簡単に言うと、ME220 集束超音波処理装置 (Covaris) を使用して DNA を平均サイズ 350 nt まで剪断しました (マイクロチューブ AFA ファイバークリンプキャップ、PN 520053)。切断された DNA (30 ng) を使用して DNA 末端修復反応を実行し、その後、プライマー NEBi5 および PE2 を使用してライブラリー合成および PCR 増幅 (10 サイクル) を実行しました。 DNA ライブラリーは、Ampure XP を使用して精製し、蛍光 (Qubit、Thermo Fisher) によって定量化し、NextSeq2000 Illumina シーケンサーを使用して配列決定しました。

シーケンス bcl イメージファイルの逆多重化と fastq 生成は、デフォルトオプションで bcl2fastq (v.2) を使用して実行されました。アダプターと品質のトリミングは、オプション (qtrim=r、ktrim=r、hdist=3、hdist2 = 2、K =) を使用して、BBTools スイート (https://sourceforge.net/projects/bbmap/) の bbduk プログラムで実行されました。 20、mink=14、trimq=16、minlen=30、maq=16)、BBTools のデフォルトのアダプターセットとショートリードのポリ G またはポリ A シーケンスを使用します。計算時間を短縮するために、BBTools スイートの重複排除プログラムをデフォルトのパラメーターで使用して、マッピング前に同一の固有分子識別子 (UMI) と挿入配列の両方を持つリードを重複排除しました。各リードの最初の 8 塩基で見つかった UMI 配列は、UMI ツール (v.1) をデフォルトのオプション (--bc-pattern NNNNNNNN を使用) で使用して抽出されました。

細菌ゲノムは、2019 年 3 月 21 日に国立バイオテクノロジー情報センターアセンブリデータベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) から次の検索語を使用してダウンロードされました: "bacteria"[Filter] AND (latest) [フィルター] AND (「代表ゲノム」[フィルター] OR 「参照ゲノム」[フィルター]) AND (すべての[フィルター] が「監視プロジェクトに由来する」[フィルター] ではない、およびすべての[フィルター] が異常ではない[フィルター]))。リストはさらにフィルタリングされ、種ごとに 1 株のみが含まれるようになり、「参照」とマークされたゲノムが優先されました。結果として得られた 5,804 のゲノム (補足表 4) を使用して参照インデックスを構築しました。インデックスは、デフォルトオプション (k = 10) を使用して、BBTools スイートの bbmap プログラムで構築されました。 5,804 の細菌ゲノムを含む参照インデックスに加えて、個別に培養された種および属レベルのグループに対して別のインデックスが構築されました。後者のグループのゲノムは、5,804 個のゲノムの初期セットから選択されました。アライメントは、パラメータ (32 bit=t -da -eoom k = 11 strictmaxindel=10 intronlen=0 t = 16 trd=t minid=0.94 nzo=t) を使用して、BBTools スイートの bbmap プログラムで実行されました。アライメントファイルは SAMtools57 でソートおよびインデックス付けされました。次に、UMI に基づく重複排除が、オプション (--soft-clip-threshold 1 --edit- distance 2 --method unique) を使用して UMI-tools (v.1)58 で実行されました。次に、BAM ファイルを処理して、種ごとの読み取り数を列挙しました。染色体名と種名の事前保存された辞書とカスタムスクリプトを使用して、各種のカウントを実行しました。 rRNA、tRNA、mRNA、およびその他の RNA タイプをコードする遺伝子間のカウントの分布は、bedtools (https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/) を使用して計算されました。以下に説明するように、mRNA コード遺伝子の数を使用して、複雑なサンプルの上位の種を選択しました。

個別に養殖された種は、それらの参照インデックスに直接マッピングされました。すべてのザイモバイオミクス混合物と膣、糞便、および堆肥のマイクロバイオームサンプルは、5,804 種を含む細菌参照インデックスに合わせて調整されました。堆肥を除くすべてのサンプルのコード領域で少なくとも 1,000 リードを持つ種を選択しました。堆肥では、カウントの高い種が少なかったため、選択を 300 リードに緩和しました。合計で、46 属に属する指定範囲の 83 細菌種がすべてのサンプルから同定されました。これら 46 属の参照インデックスが作成され (種は 5,804 の事前選択リストから選択されました)、すべての複雑な糞便サンプルと堆肥サンプルが個別にそれらの参照に合わせられました。

重複排除されたアライメントファイルは、ゲノムシーケンスおよびアノテーションファイルとともに、デフォルトオプションが適用されたリードの 5' エンドポイント分布の分析および視覚化のために、最近開発された Fivepseq パッケージ 14 への入力として提供されました。 Fivepseq は、3 nt 周期性 (FFT) の存在、CDS 開始/停止または各コドン (翻訳フレーム) 内のヌクレオチドに対する 5' カウントの分布、およびコドンおよびアミノ酸固有の保護パターンに関する情報を提供します。 Fivepseq は実行ごとに 1 つのゲノムのみを解析するため、複雑なサンプルのアライメントファイルはゲノムごとに個別に Fivepseq への入力として使用されました。属レベルの分析では、個々の種の配列ファイルと注釈ファイルが 1 つに連結されました。最後に、未処理の細菌から生成されたレポートをインタラクティブに閲覧できる、カバー率の高いオンラインリソースを http://metadegradome.pelechanolab.com にまとめました。

リボソーム保護表現型を生成するために、各アミノ酸の 30 ～ 1 nt 上流に位置するカウントの合計を取得し、アミノ酸ごとにスケールされたカウントを連結して、各サンプルのリボソーム保護を記述するベクターを取得しました。これらのベクトルは、R パッケージ統計 (v.3.6.1) の prcomp 関数を使用して実行される PCA の入力として使用されました。 PCA プロットは、R の autoplotly パッケージ (v.0.1.2) を使用して生成されました。

転写開始部位 (TSS) および UTR の枯草菌の注釈は、BSGatlas59 から取得されました。 TSS および UTR の大腸菌アノテーションは、RegulonDB60 から取得しました。 ±5 塩基対ウィンドウ内でその TSS と重複する場合、5'P リードはその TSS に割り当てられました。リード分布（拡張データ図6a）およびヒートマップ（拡張データ図6e、f）については、複製をプールし、生またはライブラリのサイズで正規化したリード数を複製全体で平均しました。 5'P リードの鎖特異的カバレッジを計算し、deepTools (v.3.3.2)61 を使用してヒートマップとして表しました。異なる遺伝子アノテーションフィーチャの 5'P リードの差分分析では、R パッケージ Rsubread (v.2.6.4) の featureCounts を使用して、各遺伝子アノテーションフィーチャの 5'P リードを列挙しました 62,63。差分分析は、edgeR (v.3.34.1)63 を使用して実行されました。

5'P 切断モチーフは、すべてのリードの 5' マッピング位置の上流および下流の領域 4 ヌクレオチドを含む、転写物の配列組成から計算されました。複数のリードが同じ位置にマッピングされた場合、その領域の塩基組成を複数回検討しました。得られた塩基周波数を使用して、シャノンエントロピー (ビット) を使用して各位置の各ヌクレオチドの寄与を計算し、R パッケージ ggseqlogo64 で配列ロゴの作成に進みました。

分類ツリーは、graphlan ツール (v.0.9.7) (https://huttenhower.sph.harvard.edu/graphlan) を使用して生成されました。私たちのサンプルで同定された 84 種すべての細菌種の分類系統情報は、NCBI e-utilities の efetch プログラムを使用して NCBI 分類データベースからダウンロードされました。ツリーには、ライブラリーのサイズ、3 nt の周期性、優先リボソーム保護フレーム、および各属の酵素注釈の存在に関する情報が注釈付けされています (補足データ 1)。ライブラリーのサイズは、サンプルごとの種ごとの mRNA リードの最大数と等しく、範囲は 0 ～ 1 (100 万以上) リードでした。 3 nt 周期性は、fivepseq パッケージによって計算された、3 nt 周期性波の FFT 信号の絶対値とリボソーム保護フレームの優先度を考慮して計算されました。 FFT の場合、開始または終了のいずれかに整列された転写産物のシグナルの最大数が取得されました。リボソーム保護フレームの優先度は、各フレーム Fi について、fivepseq パッケージによって 2 × F/(∑1F1 − Fi) として計算された FPI の値に基づいて評価されました。最大の絶対 FPI 値を持つフレームは (誤って) 優先されているとみなされ、この優先の有意性は、指定されたフレーム内のカウントを他の 2 つの組み合わせと比較する t 検定 P 値に基づいて評価されました (FPI および P 値は、 Fivepseq 出力の Frame_stats.txt ファイル)。正の FPI 値は、各コドンのヌクレオチドの 1 つが平均してカウントが高い (優先される) ことを意味し、負の値は、ヌクレオチドの 1 つが平均してカウントが低く (誤って優先される)、他の 2 つのヌクレオチドのカウントが高いことを意味します。たとえば、F1 が優先される場合、F1 は正の FPI 値を持ち、保護の単一の優先フレームとしてツリー内で強調表示されます。一方、F2 が (誤って) 優先される (負の FPI 値を持つ) 場合、ツリーは強調表示されます。優先フレームとして F0 と F1。 FFT 値と FPI 値は両方とも 0 ～ 1 の範囲にあり、2 つの値の最大値が 3 nt の周期性の強さを表すために採用されました。酵素の注釈は、EggNOG データベース (v.5.0)65 から取得しました。各属の各酵素の存在は、その酵素で注釈が付けられた属内の種の割合に応じて、0 から 1 までの数値としてカウントされました。ツリーは、対応する不透明度でこれらの値を強調表示します。

機能分析は、ストレス条件と対照条件の間で存在量が異なるか、フレーム保護が異なる遺伝子のリストに対して実行されました。各転写産物の FPI は上記のように計算されました。 FPIの変化倍数は、各転写産物のストレス/変異状態と未処理/野生型対照の間の平均FPIの差として計算されました。各転写産物の 5' エンドポイント数の差分存在量は、適応型スチューデント t 検定事前収縮推定 (apeglm) を使用して、DESeq2 R パッケージ 66 で発現 log2 (変化倍数) として計算されました。

遺伝子セット濃縮分析は、発現倍率変化差または FPI 値のいずれかに基づいて、R パッケージ WebGestaltR67 を使用して実行されました。各種の GMT 形式のファイルは、Uniprot タンパク質のアノテーションを変更することによって取得され、エンリッチメントデータベースとして使用されました。各種の注釈 GFF ファイルは、参照遺伝子リストの生成の基礎として採用されました。 P 値の有意性は超幾何検定で計算され、FDR は多重検定の補正に使用されました。

配列決定された膣サンプルの収集と処理は、ストックホルムの地域倫理審査委員会によって許可されました (番号 2017/725-31)。健康なドナーからの匿名化されたサンプルのみが使用され、サンプルがバイオバンクに保管されていなかったため、糞便サンプルと培養物に対する倫理的承認は審査委員会によって放棄されました。サンプル収集前にすべてのドナーからインフォームドコンセントを得た。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

配列決定データは、受託番号 2 で GEO に寄託されています。 GSE153497。この研究で生成された Fivepseq のすべての出力ファイルは、SciLifeLab データリポジトリ: https://doi.org/10.17044/scilifelab.22284709 に保管されています。膣サンプルのカバレッジトラックは、https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305991 に保管されています。ソースデータは Figshare (https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305955) に保管されています。

Fivepseq v.1.2.0 プログラムのコードリリースは、https://github.com/lilit-nersisyan/fivepseq/releases/tag/v1.2.0 で入手できます。図の生成に使用される残りのスクリプトとソースデータファイルは、GitHub (https://github.com/lilit-nersisyan/Atlas-of-mRNA-translation-and-decay-for-bacteria/) に寄託されています (リリース v.1.0)。 (https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305955)。

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有益な議論をしていただいた Pelechano、Kutter、Friedländer 研究室のメンバー、I. Piazza および V. Hauryliuk に感謝します。 D. Omnus、J. Karlsen、F. Righetti の支援、E. Loh、K. Jonas、P. Hudson、C. Condon、V. Hauryliuk の細菌株共有、そして pEC622 プラスミドの提供について Emmanuelle Charpentier の研究室に感謝します。。このプロジェクトは、スウェーデン財団のStarting Grant (Ragnar Söderberg Foundation)、Swedish Research Council (nos. VR 2016-01842、2019-02335、2020-01480、および2021-06112)、Wallenberg Academy Fellowship (no. 2016.0123) によって資金提供されました。、Vinnova (番号 2020-03620) およびカロリンスカ研究所 (SciLifeLab フェローシップ、SFO および KI 基金) が副社長に就任。 EU H2020-MSCA-IF-2018 プログラム (助成契約番号 845495 – TERMINATOR に基づく) および MoESCS RA 科学委員会による LN への助成金 (番号 21SCG-1F006) の開始。 MW への RED ポスドクフェローシップ (番号 2021、SciLifeLab-KI)。スウェーデン研究評議会 (番号 2021-01683 および 2021-06112) から JD; セーダーバーグ財団をLEに。イノベーション大学大臣 (番号 PGC2018-098073-A-I00 MCIU/AEI/FEDER、UE) から JH-C. 中国国家重点研究開発プログラム (番号 2017YFC0908405) および中国国家自然科学財団 (番号 81870187) を WW に譲渡。 LMSVP と WW への ERC 高度研究者補助金 (番号 742804) は、それぞれ STINT (番号 CH2018-7750) と中国国立自然科学財団 (番号 81911530167) からの中国・スウェーデン共同モビリティ補助金からの支援を認めています。計算解析は、ウプサラ先端計算科学学際的センターを通じてスウェーデン国家コンピューティングインフラストラクチャーから提供されたリソースを使用して実行されました。このリソースの一部は、助成契約 2 号を通じてスウェーデン研究評議会から資金提供を受けました。 2018-05973。

カロリンスカ研究所が提供するオープンアクセスの資金提供

これらの著者は同様に貢献しました: Susanne Huch、Lilit Nerssisyan。

SciLifeLab、微生物学、腫瘍および細胞生物学部門、カロリンスカ研究所、ソルナ、スウェーデン

スザンヌ・フッチ、リリット・ネルシシアン、マリア・ロパット、ドナルド・バレット、メンジュン・ウー、ヴィセント・ペレチャノ

アルメニア生物情報学研究所、エレバン、アルメニア

リリット・ネルシシアン & ネリ・ヴァルダザリアン

アルメニア国立科学アカデミー分子生物学研究所、エレバン、アルメニア

リリット・ネルシシアン & ネリ・ヴァルダザリアン

スウェーデン、ストックホルム、カロリンスカ研究所、トランスレーショナルマイクロバイオーム研究センター、微生物学、腫瘍および細胞生物学部門

ジン・ワン、ヴァレリー・D・ヴァレリアーノ、フアン・ドゥ、ラース・エングストランド

マドリード工科大学植物バイオテクノロジーおよびゲノミクスセンター - 国立農業食品研究技術研究所、モンテガンセド UPM キャンパス、マドリード、スペイン

ハイメ・ウエルタ・セパス

Bio-Med Big Data Center、CAS Key Laboratory of Computational Biology、上海栄養健康研究所、中国科学院大学、中国科学院、上海、中国

ウー・ウェイ

スタンフォードゲノムテクノロジーセンター、スタンフォード大学、パロアルト、カリフォルニア州、米国

ラース・M・スタインメッツ

スタンフォード大学医学部遺伝学科、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ラース・M・スタインメッツ

欧州分子生物学研究所、ゲノム生物学ユニット、ハイデルベルク、ドイツ

ラース・M・スタインメッツ

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VP、SH、LN がこの研究を考案し、設計しました。 SHはDB、JW、VDVLNの支援を受けて実験作業を実施し、SH、MR、MWはJH-Cの支援を受けてデータ分析を実施した。 DBWW と LMS は、初期の概念化とデータ解釈に貢献しました。 LE と JD はデータの解釈、設計、監督に貢献しました。 SH、LN、VP が最初の原稿を起草し、著者全員がそれを改訂しました。副社長が研究を監督した。

ヴィセント・ペレチャノへの通信。

VP、SH、LN は 3 N Bio AB の共同創設者であり、この原稿で説明されている研究の一部に関して特許出願を行っています。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた Irina Artsimovitch と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

A、fivepseq14 によって報告されている枯草菌に対する遺伝子特異的な 3 塩基保護。各点は、遺伝子と、その優先保護フレームの三角形の境界 (F0、F1、または F2) への近さに対応します。 NT コントロール細胞は緑色、ポリリボソーム関連 mRNA 分解中間体は青色、CAM 処理細胞は黄色、ランダムに断片化された細胞は赤色で示されています。 B、ポリリボソーム画分単離後の枯草菌の5PSeqメタジーン解析（図1参照）。

AL、メタジーン 5PSeq 保護、高速フーリエ変換 (FFT)、相対フレーム保護、および同定された RNase を示す複数の種のメタジーン分析 (図 1 参照)。

A、NT、およびB. subtilis 野生型株 (168 trpC2) の断片化コントロール、ならびに rnjA、rnjB ノックアウト株。 B 熱ショックを受けた野生型および RNase 変異型枯草菌株。 C. NT コントロールおよび大腸菌 Dh5α 株の断片化サンプル、および化膿連鎖球菌 RNJA の異種発現を伴う TOP10。切断モチーフの優先性は、シャノンのエントロピーに基づくヌクレオチド寄与の尺度を使用して計算されました (図 1C と同様)。

Fivepseq によって測定されたアミノ酸特異的なリボソームの停止を示す折れ線プロット。 A、L. plantarum、L. reuteriおよびB. subtilisにおけるNTおよびMUP処理を比較するイソロイシン(Ile)一時停止(-14nt)。 B、CAMに応答して複数の種について5pseqで測定した、相対的な状況特異的なアラニン（Ala）およびセリン（Ser）リボソームの停止（-8nt）。 RNase J を欠く大腸菌においてのみ、5'P デグラドームプロファイルはリボソームストールの一塩基分解情報を提供しません。 CD、ストレス条件におけるL. plantarumおよびB. subtilisの各コドンから14nt上流の5Pカウントに基づく主成分分析プロット。 B. subtilis の NT 対照サンプルは、異なる増殖期 (OD600 それぞれ 0.2 ～ 0.3 および 0.6 ～ 0.8) で収集されました。各コドンの寄与は、灰色のローディングベクトルで示されます。 PC1 と PC2 で絶対的な重みが最大のフィーチャに対応する、負荷が最も長いフィーチャが強調表示されます。ラベルの上矢印は、コドンのストレス条件下で 5P 数が増加することを示します。 L. plantarum と B. subtilis の間で共通するアミノ酸のコドンは、ストレス固有の色で強調表示されます。ＥＦ、相対的なＡｒｇおよびＧｌｎは、Ｌ．プランタルム（２７時間）および枯草菌（８日間）の定常期増殖において一時停止する（約１４ｎｔ）。

エンリッチメント解析を実行する際は、未処理サンプルと比較したストレスで劣化しているリードの log2 倍変化 (相対存在量)、またはフレーム保護指数 (FPI) の log2 倍変化のいずれかが考慮されます。誤検出率が 0.05 未満の結果のみが表示されます。ヒートショックにおけるAB枯草菌と大腸菌。高塩分中のBB枯草菌。 CB subtilis と L. plantarum は定常的に成長しています。

A、正常および摂動条件下での枯草菌株（左）および大腸菌株（右パネル）の所定の遺伝子アノテーション特徴と重複する5' Pリードのパーセンテージ（%）（Y軸）を示す棒グラフ。夾雑物 rRNA リードは分析から除外されました。 B、B. subtilis コントロールおよびさまざまな RNase ノックダウンの自然対数スケールで正規化されたライブラリーサイズの 5' P リードに基づく主成分分析。軸は主成分 1 および 2 を表します。C、野生型枯草菌株に対する RNase ノックアウトの miscRNA の 5' P リード量の log2 倍変化を示すヒートマップ。 D、C と同様ですが、5' UTR 用。 E、B. subtilis コントロールおよびさまざまな RNase ノックアウトの 5' UTR (この場合は開始コドン) の末端部位 (TES) を中心とするライブラリーサイズ正規化 5' P リードの鎖特異的範囲を示すヒートマップ。ヒートマップの各行には 1 つの 5' UTR が表示されます。破線は 5' UTR (つまり TSS) の開始部位を示します。 F は E と同じですが、大腸菌用です。

A、使用されたリード長（計算上トリミングされた）の関数としての一意にマッピングされたリードの相対数（各サンプル内でスケーリング）。 B、ZymoBIOMICS Microbial Community Standard の凍結細胞懸濁液からの 5PSeq 分析 (DNA 分析を目的)。各種に割り当てられたリードの数は丸でマークされています。相対フレーム保護と高速フーリエ変換 (FFT)、および酵素の有無 (図 1.C、糞便マイクロバイオームからの 5PSeq 分析)。割り当てられたリードの数は丸でマークされています。選択された種の in vivo アミノ酸特異的 (Ala) 3-nt リボソーム保護周期の例。 D、堆肥マイクロバイオームについても同様。

A、ゲノム DNA の存在量に基づく、使用した糞便培養物の相対組成。 B、選択された特徴に関する 5PSeq メタ遺伝子の存在量を示す折れ線プロット。起源の文化に応じた種特異的な異なる応答を示します。 C、適用された薬物治療に対してほとんど反応を示さないバシロタ・ファエシウムの例。 D、RNase J を欠くバクテロイドータ種も、薬物治療に応答して 5'P デグラドームプロファイルの明らかな変化を示します。

補足図。 1 ～ 8、表 1 ～ 7 の説明、およびゲルのトリミングされていないスキャン。

表 1: この研究で使用したオリゴヌクレオチド。表 2: この研究で分析されたサンプルとライブラリの概要。表 3: B. subtilis (subsp. subtilis 168trpC2)、E.大腸菌（MG1655株）およびL.プランタルム。強化 P 値は超幾何テストで計算され、FDR と R パッケージ WebGestaltR を使用して複数のテスト調整が実行されました。表 4: B. subtilis のさまざまなゲノム特徴に由来する RNA の量に対する RNase ノックアウトの影響。この表には、UTR、TSS、コード領域、およびその他の RNA および tRNA の log2 (変化倍数) が含まれています。表 5: NCBI から取得され、アライメントに使用された 5,804 個の原核生物ゲノムアセンブリのリスト。表 6: すべての研究サンプルで特定された比較的高いカバー率を持つ種のリスト。表 7: 研究サンプル全体で 5P-seq を使用した RNase の推定発現 (RPM)。

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転載と許可

Huch、S.、Nersisyan、L.、Ropat、M. 他細菌の mRNA 翻訳と分解に関するアトラス。 Nat Microbiol 8、1123–1136 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01393-z

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受信日: 2022 年 6 月 16 日

受理日: 2023 年 4 月 19 日

公開日: 2023 年 5 月 22 日

発行日：2023年6月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01393-z

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