これまで特徴づけられていなかったイルカの口内の長方形の細菌構造

Nature Communications volume 14、記事番号: 2098 (2023) この記事を引用

4218 アクセス

36 オルトメトリック

メトリクスの詳細

未培養の宿主関連微生物の多様性に関しては、まだ解明されていないことが多くあります。ここでは、バンドウイルカの口の中の長方形の細菌構造 (RBS) について説明します。 DNA染色により、RBS内に複数の対になったバンドが明らかになり、縦軸に沿って分裂する細胞の存在が示唆されました。極低温透過型電子顕微鏡と断層撮影により、S層状の周期的な表面被覆によってカプセル化された、細胞であると思われる平行な膜結合セグメントが示された。 RBS は、先端に糸の束が広がった珍しい線毛のような付属器官を示しました。我々は、顕微操作されたRBSのゲノムDNA配列決定、16S rRNA遺伝子配列決定、蛍光in situハイブリダイゼーションなどの複数の証拠を提示し、RBSが細菌性であり、同様の形態を共有するSimonsiella属およびConchiformibius属（ナイセリア科）とは異なることを示唆している。そして分割パターン化。私たちの発見は、顕微鏡などのゲノミクスを補完するツールを使用した特徴付けを待っている、新しい微生物の形態とライフスタイルの多様性を強調しています。

微生物の世界の最も初期の記述は、「動物」の形態と運動パターンを中心にしていました1。ファン・レーウェンフックの革命的な発見から数世紀にわたり、ステラ属の星型細菌 2,3 からミクソバクテラル目 4,5 に特徴的な多細胞子実体に至るまで、多種多様な微生物の形態が記載されてきました。形態は生物学的に重要な特性であり、多くの場合、生物のライフスタイルや環境状況から生じる選択圧によって、時間の経過とともに高度に保存され形成されます6。実際、細胞の形態は、運動性、栄養素の獲得、細胞分裂、宿主との共生を含む他の細胞との相互作用において重要な役割を果たしており、これらはすべて生存の強力な決定要因です7。このように、形態学的および構造的研究は、微生物の生命体と、種が機能し、その環境に影響を与えるメカニズムについての洞察を集めるための魅力的なルートを提供します。さらに、生命の樹の未知の枝にある多様な微生物の構造と機能を特徴付けることは、進化についての理解を広げる機会を提供し、光遺伝学 8 や CRISPR の開発に代表される、バイオテクノロジーや医学における無数の応用につながる可能性があります。遺伝子編集に基づく9.

ゲノミクスは、微生物の世界を説明するための強力なレンズとして機能します。近年、メタゲノム解析および単細胞ゲノム解析により、細菌ドメインにおける既知の微生物門レベルの系統の数がほぼ 4 倍に大幅に増加しました 10、11、12、13。新しく発見された生物のゲノムの配列決定は、新しい機能システム、タンパク質変異体の種類、ライフスタイルの発見につながり 11、14、15、16、17 、系統発生的多様性と機能的可能性の間の相関関係を示しています 18。しかし、そのようなアプローチの適用可能性は、よく特徴付けられている生物のものと相同なタンパク質および制御システムにほとんど限定されています。真に新規である、および/またはその遺伝的基盤が不明である表現型および機能の予測には、一般に補完的な知識が必要です。地球上のほとんどの微生物種は実験室培養に抵抗があるため（2016 年には、ほぼ門レベルの系統の 72% に培養された代表的な微生物が存在しなかった）19、顕微鏡検査などの培養分離株を必要としない方法は、魅力的で補完的なルートを提供します。これは、培養されていない系統の新しい形態学的および機能的特性を研究するためのものです。たとえば、極低温電子顕微鏡法 (cryoEM) と断層撮影法 (cryoET) の最近の進歩により、無傷の細菌細胞を数ナノメートルの解像度で 3 次元 (3D) イメージングできるようになり 20、新しい微生物の発見と特性評価における重要な進歩につながりました。構造21、22。現在、細胞生物学に関する私たちの知識は、培養可能な細菌の観察と実験に主に限定されており、そのため、実験室条件で増殖する微生物に対する私たちの理解には重大な偏りが存在します。「培養されていない大多数」を研究するための顕微鏡法と非配列決定ベースの技術の使用は、進化した細菌のライフスタイルの完全な多様性を特徴付けるために不可欠であり、特にバンドウシの口腔など、比較的研究されていない環境にある細菌を特徴付ける取り組みには不可欠である。イルカ (Tursiops truncatus) は、新規微生物と機能的可能性の豊富なコレクションを保有しています 16,23。

微生物細胞の形状は多様であるにもかかわらず、長方形の構造はまれであり、遺伝的基盤はほとんど理解されていません。このような構造には、長方形の個々のセルと長方形を形成するセル集合体の 2 つのタイプがあります。私たちの知る限り、非真核生物の長方形細胞の発見はこれまでのところ、好塩性古細菌からなる好塩菌科に限定されています。この科の既知の長方形細胞には、Haloquadratum walsbyi24、Haloarculaquadrata25、および多形性属 Natronrubrum のメンバー 26 が含まれます。最近、FtsZ ベースの分裂が立方体形の線虫共生生物 Candidatus Thiosymbion cuboideus で観察されており 27、細菌または古細菌であると考えられる追加の長方形の細胞が高塩分環境で発見されていますが、分類学的には特定されていません 28。真核微生物の中でも、珪藻は二次元で視覚化すると長方形の外観を持つことがありますが、これらの細胞は直方体ではなく円筒形です29。さまざまな細菌は、球状細菌のシート（例、ティオペディア・ロゼア属およびメリスモペディア属30）、球状細菌の立方体構造（例、サルシナ属およびユーカプシス属30）、円盤状細菌によって形成される長方形のトリコームなど、長方形の細胞塊を形成します。 (例、Oscillatoria limosa および他のシアノバクテリア 30)。

微生物の世界では、横軸に沿った典型的な細胞分裂パターンから分岐する細胞もまれです。 2 つの素晴らしい例は、Candidatus Thiosymbion oneisti と Candidatus Thiosymbion hypermnestrae 31、32、33 であり、これらは海洋線虫の表面でのみ発見されています。この分裂パターンは宿主への愛着を維持すると考えられています 31,32。同様に、ナイセリア科のアリシエラ属、シモンシエラ属、およびコンキフォルミビウス属のメンバーは縦方向に分裂し、これが口腔内のヒト上皮細胞への接着を助けると考えられています 34。これらの分類群は、多細胞細菌とみなせるという点でさらに注目に値します。縦分裂する細菌のその他の例としては、スピロプラズマポールソニ 35 や、海洋繊毛虫ケントロフォロスを宿主とする共生生物のクレードであるカンジダトゥスケントロン属 36、37 が挙げられます。多様な細菌の生殖方法についてのこのような洞察は、細胞生物学の包括的な理解を構築するために不可欠です。

今回我々は、イルカの口腔サンプルから異常な長方形の細菌構造（RBS）を発見し、位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡を使用してその細胞の大きさとDNAパターンを特徴づけます。 DNA の規則的なバンドは、これらのユニットが内膜と外膜でカプセル化された個々の細胞のシートであることを示唆していますが、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISH) 実験とメタゲノム配列決定は、それらが細菌であり、このクラスの潜在的なメンバーであることを強く示唆しています。ベータプロテオバクテリア。極低温透過電子顕微鏡（cryoTEM）とcryoETを使用して、RBSのエンベロープ構造を特徴付け、RBSの端から突き出て先端で広がる不均一な付属物の束など、これまで観察されていなかった表面の特徴を発見します。これらの発見は、未培養微生物の性質を探索するための高解像度顕微鏡の力を強調しています。

口腔綿棒サンプルは、2012 年、2018 年、2022 年の 3 つの異なる期間中に、米国カリフォルニア州サンディエゴ湾で米国海軍海洋哺乳類プログラム (MMP) の管轄下で 8 頭のバンドウイルカ (Tursiops truncatus) の口から収集されました (方法）。 RBS は、位相差顕微鏡画像ですぐに明らかでした（図 1a ～ e）。 RBS は直方体に似ていました。それらは円筒形ではありませんでした（補足ムービー 1）。これらは、グラム染色後にグラム陰性の特徴を示しました（図1f）。 FM4-64 色素は RBS のどの部分も染色しなかったため、FM4-64 を使用した膜染色の試みは失敗しました。 RBS には、DAPI 染色による複数の平行な蛍光バンドが含まれていました（図 1b–e）。一部のRBSでは、隣接するDNAバンドペアが「H」のように見え（図1g、白い矢印）、DNAバンドが分離を受けて長軸に沿って分裂の過程にある2つの棒状細胞を示唆しています27。 RBSは、長方形ユニットの寸法に基づいて2つの形態型にクラスター化されました（図1h）。単一のイルカの口腔綿棒サンプルからの材料を使用して、23 個の RBS の長さと幅を定量化しました。形態型 A は、長さ中央値 3.95 ± 2.89 μm 絶対偏差 (MAD) 中央値および幅中央値 5.08 ± 0.10 μm MAD (n = 15 RBS) を示しました。形態型 B は、長さの中央値が 3.08 ± 0.93 μm MAD、幅の中央値が 2.21 ± 0.56 μm MAD (n = 8 RBS) でした。長さと幅の両方の寸法は、2 つの形態型間で大きく異なりました (長さについては p = 0.02; 幅については p = 10−10; 両側ウェルチ t 検定)。異なる形態型は、異なる細胞型または分類群（株または種など）、発生の異なる段階にある細胞、または環境条件に応じて形状が変化した細胞を表す可能性があります。

a イルカ口腔上皮細胞表面の RBS の位相差画像 (矢印は一例を示す)。補足ムービー 1 も参照してください。 b、c 一部の RBS は、DAPI 蛍光の長いバンドを示しました。位相コントラスト画像を (b) に示し、(c) ではシアンの蛍光オーバーレイを示します。 d、e 他の RBS は、より短い DAPI バンドを示しました。位相コントラスト画像を (d) に示し、(e) ではシアンの蛍光オーバーレイを示します。暗点（矢印）は、DAPI 染色バンドに対して垂直な線で組織化されました。 DAPI 染色されたバンドはペアで組織されているように見えました。 f グラム染色 RBS はグラム陰性の特徴を示します。挿入図: グラム染色した枯草菌 (Bs、グラム陽性) および大腸菌 (Ec、グラム陰性)。 g RBS 内の隣接する DNA バンドのペアは、「H」のような形状 (矢印) を形成します。これはおそらく、DNA バンドが縦方向の分裂を受けている細胞内で分離された核様体であるためです。 h 2 つの RBS 形態型は、長さと幅の分布が異なります。 15 個の RBS-A の幅と長さの中央値は、それぞれ 3.95 ± 2.89 μm MAD と 5.08 ± 0.10 μm MAD であり、8 個の RBS-B では、それぞれ 3.08 ± 0.93 μm MAD と 2.21 ± 0.56 μm MAD でした。オレンジと青の十字の中心はそれぞれ RBS-A と RBS-B の平均を表し、腕の長さは ±1 標準偏差を表します。

我々は、サンプルごとに 226 視野の画像データを収集するハイスループットの自動位相差顕微鏡ワークフローを使用して、8 頭のイルカから収集した 73 個の口腔スワブサンプルのセットにおける各形態型の RBS の有病率を評価しました (補足データ 1)。形態型 A の RBS (以下、RBS-A と呼びます) は、8 頭中 7 頭のイルカの 39/73 サンプルから検出されました (イルカあたりのサンプル数は一定ではなく、異なる年に異なる口腔部位が拭き取られたことに注意してください)。形態型 B の RBS (以下、RBS-B と呼びます) は、8 頭中 6 頭のイルカの 42/73 サンプルから検出されました。異なる口腔部位から収集されたこれら 73 サンプルのうち 25 サンプルでは、RBS が口蓋サンプル (RBS-A = 5/5; RBS-B = 4/5) および歯肉サンプル (RBS-A = 12/15; RBS- B = 14/15）、しかし頬側サンプルでは頻度は低くなります（RBS-A = 0/5; RBS-B = 2/5）。したがって、RBS はイルカの口腔内で安定したコロニー形成者であり、優先的にコロニー形成される場所があると推測されます。

この研究では、RBS-A に焦点を当てました。この形態型はイルカの口腔サンプルに多く存在し、他の既知の微生物とは形態学的に区別できるためです。

RBS の興味深い形態を考慮して、我々は次にそれらの分類学的所属を決定しようとしました。 RBS は形態学的に、哺乳類の棒状の経口共生生物である Simonsiella 属および Conchiformibius (ナイセリア科) のメンバーに似ています 39。サンガークローンライブラリーと、同じ集団の 38 頭のイルカの歯肉スワブサンプルの以前の 16S rRNA 遺伝子アンプリコン調査からの 454 個のパイロシーケンスデータの再分析では、S. muelleri (Simonsiella 属の唯一の種) または Conchiformibius 属は検出されませんでした。これらのサンプルのいずれからもアンプリコンが検出されましたが、これらのイルカの口腔サンプルからはナイセリア科の他のメンバーも検出されました。推定上の S. muelleri 配列タイプは、同じアンプリコン研究で検査された 1 頭のアシカの口と胃液からサンガーライブラリーで検出されました 23 (NCBI アクセッション番号 JQ205404.1)。この部分的な 16S rRNA 遺伝子配列は、部分的な S. muelleri ATCC 29453 16S rRNA 遺伝子配列 (NCBI アクセッション番号 NR_025144.1) と 99% のクエリカバレッジを超えて 94.6% の同一性を持っています。前の研究では、海洋哺乳類に与えられるアシカ（口と胃）、水、および魚種から、サンガーライブラリーで他の 5 つのナイセリア科配列タイプが検出されました 23。一方、454回のパイロシーケンス調査では、イルカ(胃、呼吸器系)、アシカ(口、胃)、魚、海水から4つのナイセリア科配列タイプが回収された。これらの確実な同定は、イルカの口腔サンプルからは検出されなかったものの、以前の研究では S. muelleri およびナイセリア科 DNA が正常に抽出できたことを示しています 23。

次に、54 個のイルカの口腔サンプルに対して 16S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定を実行し (方法)、その結果、5,339,751 個の配列読み取りから 1,116,394 個の増幅配列変異体 (ASV) が検出されました。これら 54 個のサンプルのうち、48 個は位相差顕微鏡法による RBS のハイスループット方法でスクリーニングされました (方法)。 RBS-A と RBS-B はそれぞれ 22/48 サンプル (45.8%) で検出されましたが、同じ 22 サンプルでは検出されませんでした。いずれかの形態型が 30/48 サンプル (62.5%) で検出されました。希薄化曲線は、配列決定の深さがASVの豊富さの飽和に近い結果を得るのに十分であることを示唆しました（図2a）。これらのサンプルのアリコートにS. muelleriを意図的にスパイクした後、以前は陰性だった口腔スワブサンプルからS. muelleri配列を回収できたにもかかわらず、これらのサンプルではナイセリア科アンプリコンは検出されませんでした（図2b）。 RBS-A および RSB-B 陽性サンプルに共通の ASV は、それぞれ補足表 1 および補足表 2 に示されています。

イルカの口腔サンプル (n = 54) をディープ 16S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定に供しました。 a 54 個の配列決定されたイルカの口腔サンプルのレアファクション曲線。 b 54 頭のイルカの口腔サンプルで検出されたベータプロテオバクテリアクラスの各ファミリーについて、メンバー ASV の相対存在量がプロットされています。 Simonsiella 属は Betaproteobacteria 綱 Neisseriaceae のメンバーであることに注意してください。このファミリーに関連する ASV は検出されませんでした。位相差顕微鏡を使用した視覚的検査 (「方法」を参照) により、スクリーニングされた 73 サンプル中 39 サンプルで形態型 A または B のいずれかの RBS が明らかになりました (合計 73 サンプルが RBS について視覚的にスクリーニングされたことに注意してください。54 サンプルはアンプリコン配列決定に使用され、残りはアンプリコン配列決定に使用されました)他の実験用）（補足データ 1）。 c S. muelleri の純粋培養物と S. muelleri をスパイクしたイルカの口腔サンプル (RBS-A を含むことが確認された) の配列決定により、Neisseriaceae 科 ASV が検出されました。 S. ミュレリ陽性サンプルと並行して調製および配列決定した場合、同じ ASV が未変化の状態 (S. ミュレリを添加していない) の同じイルカの口腔サンプルから 0.1% 未満の相対存在量で検出されました。研究室環境にS. muelleriを導入する前のイルカの口腔サンプルからはASVは検出されなかった。

円筒形の海洋珪藻は二次元では長方形に見えるため、RBS の海洋起源と長方形の性質により、それらが海洋珪藻 (例: Skeletonemacostatum) である可能性があるという推測も生まれました。したがって、次に我々は、RBS の潜在的な真核生物起源を評価しました。標識された真核生物 (Euk-1209) プローブと細菌 (Eub-338) プローブを使用して FISH を実行しました。後者は細菌と古細菌の両方とハイブリダイズすることが知られています。対照として、S.costatumおよび細菌Escherichia coliを培養して含めました。 Eub-338プローブは大腸菌とRBSの両方にハイブリダイズしましたが、Euk-1209真核生物プローブはS.costatum細胞のみにハイブリダイズしました（補足図1）。これは、RBSが真核生物ではなく、したがって珪藻ではないことを示しています。

RBS の特定の性質に関する先験的な仮説はこれ以上ありませんでした。我々は、RBS の正体を解明するためにさまざまな一般的なアプローチを追求しました。まず、RBS を濃縮することを目的として、多様な細菌の増殖に使用される 3 つの培地 (方法) で好気性および嫌気性条件下で口腔サンプルを培養しました。残念ながら、顕微鏡での培養検査では RBS は確認できませんでした。これは、RBS の増殖要件が、哺乳動物の微生物叢から単離された典型的な細菌の増殖要件とは異なることを示しています。

我々は、固体表面上で直接 RBS を培養する可能性をさらに調査しました。 2022 年の綿棒サンプルのうち、RBS の生存率を維持する可能性を最大化するために、収集直後に 5 つを 20% グリセロール中で保存しました。単一細胞顕微鏡検査により、多数の RBS を含むサンプルを含む 2 つのグリセロールストックが特定されました。これらのストックを、BSTSY-FBSまたはBHI-血液培地のいずれかを含む寒天プレートに接種した(方法)。 BSTSY-FBS プレートは S. muelleri の増殖を可能にし、37 °C で好気的にインキュベートしました。 BHI 血液プレートは通常、哺乳類からのさまざまな細菌の共生生物を増殖させるために使用されます。これらのプレートを嫌気的に 37 °C でインキュベートしました。 3 週間の延長インキュベーションの後、BSTSY-FBS プレート上にはコロニーは見られませんでしたが、S. muelleri の対照サンプルでは 1 ～ 2 日後に大きなコロニーが形成されました。 BHI 血液プレートには集合的に約 300 個のコロニーが含まれており、そのうち 288 個をハイスループット単細胞顕微鏡を使用して検査しました 38。どのコロニーにも RBS と同様の形態を持つ細胞は含まれていませんでした。まとめると、ゲノミクスアプローチを可能にするという観点からは残念ではあるが、我々が RBS を培養できないことは、RBS がそのようなアプローチを使用して容易に培養可能な S. muelleri ではないというさらなる裏付けとなる。

我々の次の戦略はミニメタゲノミクスを採用しました。これは、複雑なコミュニティから少数の細胞がサブサンプリングされ、それらの DNA が多重置換増幅 (MDA) を使用して増幅されるアプローチです。注目すべきことに、このアプローチは、細胞溶解が成功すると仮定すると、メタゲノム分析は生命のあらゆる領域のあらゆる細胞からのDNAを明らかにするはずであるため、同一性の可能性に関する先入観を大幅に回避します。ゲノム配列決定のために RBS-As をキャプチャするために、レーザーキャプチャマイクロダイセクション、マイクロ流体工学、および細胞マイクロマニピュレーションという 3 つの技術を使用しました。他の細菌と比較してサイズが大きいこと、密度が低いこと、RBS-A は他の細胞や非生物表面に付着する傾向があるため、顕微操作のみで RBS-A の捕捉が成功しました（補足図 1）。それぞれ約 1 ～ 3 個の RBS-A を含む 4 本のコレクションチューブに加えて、顕微鏡の解像度では細胞が確認できない状態で、サンプル液の 4 本のネガティブコントロールチューブがマイクロピペットで収集されました。 RBS-A が他の細胞に頻繁に近接していることを考慮すると、無細胞 DNA および小さな非標的細胞も RBS-A とともに収集された可能性があります。 RBS-A 陽性および RBS 陰性サンプルからの DNA を MDA を使用して増幅し、一緒に組み立て、18 のゲノムビンに分類しました (補足図 3、補足表 3 および 4; 方法)。注目すべきことに、これらの分類群の陽性対照は実験計画に含まれていなかったが、S. muelleri、ナイセリア科、または珪藻のゲノムは回収されなかった。真核生物のビンは、ヒトゲノムまたは真菌綱マラセツィオマイセテスと一致し、そのメンバーはヒトの皮膚の共生生物として知られている40ため、汚染物質である可能性があります。古細菌の容器は回収されなかった。

ミニメタゲノミクス実験から回収された候補細菌ビンの半分はプロテオバクテリア門のメンバーであったため、次にアルファ、ベータ、およびガンマプロテオバクテリアを標的とするクラス特異的プローブのセットを使用して FISH 実験を実行しました。 RBS は、ベータプロテオバクテリアクラスのプローブに対してのみ陽性の結合を示しました (図 3)。

プロテオバクテリア門クラスのアルファプロテオバクテリア (ALF968)、ベータプロテオバクテリア (BET42a)、およびガンマプロテオバクテリア (GAM42a) のプローブを、RBS にハイブリダイズする能力について評価しました。上の行: 位相コントラスト画像。中央の 3 行は上から下に、それぞれアルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリアクラスのプローブの蛍光画像です。下段：推定DNAのDAPI染色。矢印はサンプル内の関連するセルを強調表示します。「A」形態型のRBS（図1h）は、ベータプロテオバクテリアクラスのプローブとハイブリダイズし、アルファプロテオバクテリアクラスおよびガンマプロテオバクテリアクラスのプローブとは最小限のハイブリダイゼーションを示しました。

我々は、各実験系の証拠から RBS-A の分類学的同一性についての洞察を総合しました (図 4)。 RBS-A の同一性について決定的な洞察は得られませんが、FISH の結果はベータプロテオバクテリア綱との関連を示唆し、ミニメタゲノミクス実験からベータプロテオバクテリア綱の単一の部分ゲノムが回収されました。このビン（番号16）とアルカリゲナ科との関係は、16S rRNAおよびリボソームタンパク質S3遺伝子の系統解析によって確認されました（補足図4および5および方法）。そのビンの 16S rRNA 遺伝子と一致する ASV は、RBS-A の存在が視覚的に確認され、アンプリコン配列データが入手可能なサンプルの 11/13 に存在します。

表は、MDA から回収された 18 のビンと、マイクロマニピュレーターを介して収集された RBS-A サンプルの配列決定、およびそれらの由来が推測される門を示しています。達成された最も低い分類学的同一性 (多系統門プロテオバクテリアの場合はクラス) については、アスタリスク (*) は割り当て (方法) の信頼度が低いことを示します。 RBS-A パネルは、視覚化に基づいて RBS-A を含む 4 つのサンプルのそれぞれにおけるビンの相対存在量を次のように色分けして示します: 緑色: ≥5%、黄色: ≥1% および <5%、オレンジ: > 0% および <1%、赤: 0%。ネガティブコントロールパネル (Neg) は、RBS-A を含まないと思われる各サンプルについて同じ情報を示します。 RBS-A に由来するビンの可能性を評価するための基準を以下に示します: (ゲノミクス) ビンはネガティブコントロールに存在しましたか (緑色 = いいえ、黄色 = はいだが 1% を超えることはありませんが、相対存在量が 1% 以上であることはありません。オレンジ色 = はいですが、決して 1% 以上ではありません)。 5%、赤 = はい、少なくとも 1 回は 5% 以上)? (グラム染色) この分類グループのメンバーは、RBS のようにグラム陰性であることが知られていますか? (16S 75%+) 16S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定を受け、>10 RBS-A を含むことが視覚的に確認されたサンプルの 75% 以上で検出された ASV (n = 13) のうち、この分類学的同一性の ASV はありましたか? ボックス内の数字は、この ASV が存在したサンプルの数を示します。大きくて多様なグループであるガンマプロテオバクテリア綱のレベルまでしか検出されない回収ビンについては、この基準は黄色でマークされ、ASV 数は表示されません。 (FISH) FISH の結果に基づいて、どのビンが RBS-A の潜在的な候補としてサポートされますか? バツ（†）は、グラシリバクテリア門のメンバーがゲノム研究からグラム陰性ではないと推定されていることを示します（ただし、必ずしもグラム陽性である必要はありません）92。最も可能性の高い候補は、3 つの基準すべてにおいて緑色です。

多細胞性と縦分裂への進化の経路はほとんど理解されていません。ナイセリア科におけるこれらの細菌の特徴の遺伝的基盤を特定する最近の取り組みにより、アミダーゼをコードする遺伝子 amiC2 の獲得と、主要な調節遺伝子 (mreB、ftsA など) の修飾が重要な役割を果たしている可能性が高いことが判明しました。ミニメタゲノミクス実験から回収したビンを検索して、推定上の AmiC2 タンパク質 (アミダーゼ 3、PF01520 をコードするもの) を探しました。候補はビン 4、7、9、10、11、12、および 16 (最後のビンは Alcaligenaceae に属します) で特定されました。 RBS の同一性が確認されたら、今後の研究では、その異常な形態を与える際の amiC2 の重要性を調べる必要があります。

RBS-As の高解像度の構造的洞察を得るために、cryoTEM を使用して高密度の RBS-As を含むイルカの口腔サンプルを画像化しました。低倍率のクライオTEM画像により、各RBS-Aは、並列に組織化された一見ペアのセグメントで構成されていることが明らかになりました（図5a、b）。これらのセグメントは、蛍光顕微鏡画像で見られる DAPI 染色バンドと同様の方向を向いていました (図 1c、e)。セグメントの一部のグループは他のグループから分離しようとしているように見えましたが、静的データではこれらの観察が細胞分裂を反映しているかどうかを明確に言うことはできません。セグメントは、低密度層の下にある高密度の膜状層に囲まれていました（図6a、b（右）および図7a、補足ムービー2および3）。

R2/2 ホーリーカーボン TEM グリッド上の RBS のバンドパスフィルター処理およびノイズ除去された低倍率 a、b 画像またはモンタージュ cryoTEM 画像。 d 線毛様付属器と e 近位細胞および RBS 周辺部の相互作用する小胞を示す高倍率画像。 (a) では、セグメントのペアが交互の青色の濃淡で強調表示され、セグメントのグループ間の鋭いくぼみが黒い矢印で示されています。高密度の回転楕円体物体が RBS 内に存在しました (白い矢印)。 (d) では、セグメントは黒い矢印で示される内膜 (IM) と外膜 (OM) によってカプセル化されています。 d、eは、RBSがサンプル内の他の細胞に物理的に非常に近接していることが多いことを示す代表的な顕微鏡写真です。 (e) では、RBS 周期表面カバー内の明らかな小さなくぼみ (黒い矢印) が、非 RBS 細胞または小胞と重なっています。（c〜e）の小さな暗いスポット（15 nm）は、cryoET実験（黒い矢印）の傾斜シリーズアライメントに使用される金の基準粒子です。

a、b、d、e 2 つの代表的な RBS-A 断層像のそれぞれからの 2 つの異なる深さ (a 対 b、d 対 e) での厚さ約 3 nm のスライスの例。 c、f セルラー機能の対応する手動注釈。断層像は厚い (約 500 ～ 600 nm) ため、線毛様付属物 (黄色: c、f) は、RBS-A の断層撮影ボリューム密度内の特定の深さでのみ見えました。補足ムービー 2 および 3 も参照してください。 c、f 青色、内膜。紫色の周期的な表面被覆。緑色の外膜。赤、マトリックス。スケールバー、100 nm。

単一の cryoTEM 画像。 b、c RBS-A の CryoET スライス (厚さ約 3 nm)。 (c) の赤とオレンジのボックスは付属肢の束の拡大図であり、矢印は薄い単一の付属肢を示します。 d 周期的な表面被覆を示す RBS-A の端の代表的な 2D crioTEM 画像。 e（d）の画像から選択した領域に沿った線密度プロファイルは、繰り返し特徴の間隔がRBS-A膜に平行な方向に沿って〜7〜9 nmであることを示しています。

我々は、RBS はおそらく細胞の集合体であり、各 DNA 含有セグメントが個々の細胞に対応していると仮説を立てました。以下の観察はこの仮説を裏付けています: (1) 個々のセグメントは、他のグラム陰性細菌に見られる血漿と外膜を彷彿とさせる内膜と外膜で囲まれているように見えました (図 5a、6a、b (右)、および7a); (2) セグメントは、DAPI 染色バンドおよび FISH プローブハイブリダイズバンド (図 1c、e、g、および 3) と同じ幾何学形状 (図 5a、b) に配置されます。 (3) 個々のセグメントの表面から突き出た付属物 (図 5c、d)。（4）RBS-Aは、多くの場合、互いに分離しているように見えるさまざまな数のセグメントで構成されており（図1d、eおよび6d、e）、長方形の構造が個々の細胞を反映していないことを示唆しています。（5）隣接するセグメントはH字型に見え（図1g）、縦分裂中の細菌細胞内で分離している核様体を連想させます。 (6) 最近の報告では、DNA が膜結合コンパートメントに保存されている細菌の最初の発見が記載されていますが 41、DNA が細胞小器官結合はおろか、細胞質から物理的に分離されている既知の細菌種の数は、極めて低い。対照的に、多細胞性は多様な細菌種で記録されています（参考文献 42 で概説）。

crioTEM画像では、RBSの本体に暗い球状の構造が見えました（図5c）。 1 つの断層像では、2 つの高密度の回転楕円体物体が顕著に見え、その大きさは 192 nm × 200 nm × 192 nm (体積 3.1 × 107 nm3) および 215 nm × 220 nm × 220 nm (体積 4.4 × 107 nm3) でした。小胞様構造も明らかでした。特に、〜7〜9 nmの周期性の表面被覆はRBS-Asをカプセル化しました（平均7.83±0.86 nm SD）（図6および7、および補足ムービー2および3）。この特徴は、1 つのイルカの口腔サンプルから採取した 2 つの RBS-A の高解像度 2D 顕微鏡写真から、セグメント (各画像から 2 つ) の線密度プロットを生成し、6 ～ 7 個のピークの強度ピーク間の距離を手動で測定することによって測定されました (図7d、e)。

RBS-A 特徴のより詳細な 3D 再構成を取得するために、cryoET 実験を実施しました。 RBS-A 本体の厚さにより、高い傾斜角では電子ビームがほぼ完全に遮蔽されるため、傾斜シリーズの取得は RBS-A 周辺に限定されました。 RBS-A 周辺部 (エッジから <1 μm) の厚さは ~323 ～ 751 nm の範囲で、平均値は ~509 ± 132.4 nm SD (n = 15) でした (一般的に考えられる ~500 nm の閾値を超えています)生産的なクライオETイメージングの上限として。 CryoET で RBS-A 体を画像化する試みは、金の基準点と細胞の特徴が傾けるとすぐに識別できなくなったため失敗しました。これは、標本の厚さが多すぎる多重散乱イベントを誘発したことを示唆しています 44。

線毛45,46に似た付属物がRBS-Aから突き出ていた。これらの付属肢は、多くの場合、束を形成して先端で広がり、時には互いに絡み合ったり、交差したりする毛状の構造で構成されていました（図6bおよび7b、c）。付属肢の束は構造的に不均質であり、長さ、束の幅、先端の数が異なりました。特に、断層像内のさまざまな特徴を調べたところ、非真核生物のアイデンティティと一致して、核を思わせる膜結合細胞小器官は観察されませんでした。

付属肢と周期的な表面被覆の両方について、サブトモグラムの平均化 47 では一貫したマップが得られませんでした。これはおそらく、RBS-A 周辺の厚さ（多くの場合 >500 ～ 600 nm の厚さ）、断層像の低い S/N 比、および連続した周期的な表面被覆の広がりを持つ領域の可変曲率など、問題の特徴の特性を制限します。サブトモグラムの平均化を成功させるには、通常、同一の構造、たとえば、同じ機能状態にあるリボソームなどの高分子複合体の反復コピーを平均化することに依存します。高度な分類手法と組み合わせて数千のサブトモグラムで構成される大規模なデータセットを使用すると、構造的および組成的不均一性の形での構造的変動を補償できます。ただし、私たちのデータセットでは、線毛様の付属物（図7a〜c）とS層状の表面特徴（図7a、d、e）の両方が構造的に不均質であり、RBS-A内にまばらに分布していました（例：、S 層状の表面特徴は RBS-As の膜全体に沿って連続的ではなく、そのストレッチ部分では異なる曲率を示します)、したがって断層像の一部でのみ観察されました。

サンプルの厚さに対処するために、極低温集束イオンビーム (FIB) 走査型電子顕微鏡 (SEM) 48 を使用して、RBS サンプル 49 のより薄いラメラをミリングしました。しかし、考えられる 2 つの理由により、氷の下に RBS-A を見つけることができませんでした。(1) 推定厚さが約 0.6 ～ 1.7 μm であるため、RBS-A は氷の下に十分に隆起した「マウンド」を形成していない可能性があります。どこで製粉するかを提案します。 (2) サンプル中の他の大きな細胞 (イルカ上皮細胞など) は、RBS-A を覆い隠す、より顕著な丘を形成しました。実際、候補地から生成したラメラには RBS-A は含まれていませんでした。この実験のデータは、今後の研究において、cryoFIB-SEMを使用して薄いラメラを作製するためのガラス化RBS-Aを含むcryoEMグリッド内の候補領域を特定するには、低温相関光学電子顕微鏡法（cryoCLEM）が必要であることを示唆しています。それにもかかわらず、細胞表面は、RBS-A 周辺で観察された特徴、すなわち線毛および S 層と同様の特徴を示しました。 RBS-As の線毛状の付属物と S 層状の周期的な表面被覆は将来の研究に値すると考えられます。

ここでは、光学顕微鏡、cryoTEM、およびcryoETを使用して、イルカの口腔サンプルの微生物叢内の新しい形態学的多様性を検索しました。形態学的多様性は、配列決定に基づく研究によるイルカの口における新しい系統発生的多様性と機能的可能性に関する以前の発見に基づいて予測された 16,23。興味深いことに、我々は珍しい RBS を発見しました。この環境に一貫して存在していたことを考えると、両方の RBS 形態型はイルカの口に固有のものであると推測されます。RBS-A と RBS-B は、それぞれ 39/73 サンプルと 42/73 サンプルで特定され、ハイスループットを使用して調査されました。この研究には 7/8 イルカと 6/8 イルカの顕微鏡画像が含まれており、これらは 10 年の間隔で収集されたサンプルに存在していました。これまでの研究では、海洋哺乳類の微生物叢が海水の微生物叢（常に海水と直接接触している皮膚の微生物叢であっても）とは異なることがわかっており、したがって、RBS が単に海水からの汚染物質である可能性は低いです。

複雑な群集から特定の細胞形態型を分類学的に同定することは非常に困難であり、多くの場合未解決のままです 28,51,52。ここで収集された結果は、RBS-A が、棒状細胞の長方形のクラスターを形成することもできる、縦方向に分裂する多細胞のナイセリア科メンバー、S. muelleri、Conchiformibius 属、または Alysiella 属に属していないことを強く示唆しています 53。まず、ここで使用したマーカー遺伝子アンプリコン配列決定ワークフローでは、ディープ 16S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定を行った 54 頭のイルカの口腔サンプルからナイセリア科アンプリコンは検出されませんでした。ただし、この分類群の細胞を意図的にアリコートにスパイクした後、このワークフローは S. ムレリを検出しました。イルカの口腔サンプル。第二に、我々の研究室でS. muelleriの培養に成功した技術を用いてRBS-Aを培養しようとする試みは失敗に終わり、RBS-AにはS. muelleriが必要とするものとは異なる増殖の生理学的要件があることが示唆された。第三に、ミニメタゲノミクス実験からはナイセリア科ゲノムが回収されませんでした。第四に、ここで提示されたRBS-A画像と、参考文献の多細胞縦分裂科ナイセリア科（アリシエラ属、シモンシエラ属、およびコンキフォルミビウス属）のTEMおよび蛍光顕微鏡画像との視覚的比較。 53 はそれらが異なる分類群であることを示唆しています。例えば、RBS はマトリックス状の材料に埋め込まれ、S 層状の構造によって完全にカプセル化されたセグメント (細胞) を含んでいるように見えますが、同じフィラメントに属する縦方向に分裂する多細胞のナイセリア科は外膜を共有しているだけであるように見えます 53 。

FISH 実験により、RBS-A は細菌であり、おそらくベータプロテオバクテリア綱のメンバーであることが示されました。ベータプロテオバクテリアのクラスのゲノムは、アルカリゲン科のミニメタゲノミクス実験から回収されました。このビンの 16S rRNA 遺伝子と一致する ASV が、アンプリコン配列決定を受けた 11/13 サンプルで検出され、位相差顕微鏡により RBS-A を含むことが視覚的に確認されました。総合すると、RBS-A は Alcaligenaceae 科のメンバーである可能性がありますが、顕微鏡検査によって RBS-A を含むことが確認されたサンプル 13 個中 2 個にはこの ASV が存在しないという発見は、この仮説に疑問を投げかけます。 1 つの可能性は、深いアンプリコン配列決定にもかかわらず、RBS-A がこれら 2 つのサンプル中に十分に低い相対量で存在し、検出されなかったということです。別の可能性としては、RBS-A はこのアルカリゲナ科の分類群ではなく、むしろアルカリゲナ科の分類群がイルカの口腔微生物叢の遍在するメンバーであるため、我々の配列決定に基づく解析で頻繁に出現したという可能性があります。このような場合、RBS-A は配列決定に基づく実験では溶菌しなかったクラスベータプロテオバクテリアであるか、実験が実施された厳格かつ制御された条件にもかかわらず、FISH の結果が偽陽性であったことを示唆します。

配列決定ベースの方法によって RBS を種レベルで同定することは、顕微操作中に RBS と混合された可能性が高い他の小細胞と RBS が頻繁に近接することや、実験室での溶解に対する抵抗性など、多くの理由により非常に困難です。重要なのは、技術的な制限により偽陰性が生じる可能性があるため、すべての陽性 RBS サンプルのミニメタゲノミクス実験に存在しないことに基づいて候補アイデンティティを除外することを躊躇していることです。たとえば、マイクロピペット針による試薬の RBS への到達を妨げる厚い細胞壁や障害物があると、細胞膜の溶解が妨げられ、DNA 抽出が妨げられた可能性があります。逆に、ネガティブコントロールでのポジティブ結果は、非特異的リードマッピング、真の汚染物質からの物質によるゲノムビンの汚染、または無細胞 DNA が原因で生じた可能性があります。培養ベースのアプローチは、最終的には RBS を同定するための最も有望なルートとなる可能性がありますが、RBS の成長に満足のいく条件を見つけるには、パラメーターの多くの組み合わせをテストする必要がある可能性があります。 RBS の分類学的同一性に関係なく、これらの微生物で進化した新しい構造的特徴は興味深いものであり、さらなる研究の発見の可能性を強調しています。

RBS におけるセグメントの対の性質は、ナイセリア科の Alysiella 属、Simonsiella 属、および Conchiformibius 属、および S. poulsonii、Ca に見られるように、二分裂の縦方向モードに起因すると考えられます。Ｔ．オニスティ、およびＣａ． T. hypermnestrae31,32,35,54。ナイセリア科のメンバーである S. muelleri では、上皮細胞が急速に脱落する際に、シートが細胞を口腔内に物理的に固定し続けるのに役立つと考えられています 34。同様の環境に生息し、その形態をもつ RBS にも同じことが当てはまるのではないかという仮説を立てています。同様の進化圧力により収斂進化を遂げた可能性がある。縦二分裂は、基板への確実な付着を形成する必要性に応じて選択される、さらに一般的な特性である可能性があります。 RBS の端のセグメントは中心に近いセグメントよりも短いことが多く、セグメントの成長が RBS 内の空間的位置によって決定されるメカニズムがある可能性があることを示唆しています。 RBSは、細菌の多細胞性と縦分裂の推進力と遺伝的基盤の理解に焦点を当てた将来の進化研究のための別の事例を提示する。

CryoTEM 画像は、RBS-A が S 層または新しい結晶構造である可能性のある周期的な表面被覆によってカプセル化されていることを示唆しました。 S 層は、一部の細菌や古細菌の外側を覆う単一タンパク質または糖タンパク質の自己組織化結晶配列です 55,56。その正確な機能は微生物によって大きく異なり、不明な場合も多いですが、S 層は、その高い代謝コスト (S 層は細胞によって合成される総タンパク質の最大約 20% を構成します)、微生物全体の偏在性を考慮すると、有益な機能を付与すると仮説が立てられています。微生物とその複数の進化的起源55,56。 RBS-A 内のセグメントが個々のセルに対応する場合、周期的な表面被覆の生成は、RBS-A 内のセル間の協力を表す可能性があります。近親者（RBS-A 内の他の細胞）の分散能力が限られており、したがって物理的に近接して位置しているため、複数の細胞によって覆われた単一の共有周期表面の共同合成が進化した可能性があります。 RBS-As は、すべてのセルをカバーするのに必要な表面積を削減することで、個々のセグメントの周囲ではなく、セルの集団の周囲をカバーする単一の周期的な表面を協調的に生成することから恩恵を受けると考えられ、そのような利点は、集合体の選択に寄与した可能性さえあります。相互に排他的ではない追加の可能性は、Thermoproteus tenax57 などの古細菌と同様に、周期的な表面被覆が RBS-A 内のセグメントの超微細構造の維持に役立つ可能性があることです。

RBS-A の最も顕著な特徴の 1 つは、線毛状の付属器です。現在、グラム陰性菌の線毛には 5 つの特徴的なクラス (シャペロンアッシャー、カーリ線維、F 型、IV 型、および V 型) があり、グラム陽性菌の線毛には 2 つの一般的なタイプ (短くて細い桿体) があります。より長く柔軟な髪の毛のようなフィラメント）45、46。他の線毛様付属器は、古細菌のハミなど、記録されています21。私たちの知る限り、特徴付けられた細菌線毛はすべて、独立した単位として存在する単一の付属物で構成されています。対照的に、RBS-A セグメントから突き出ている線毛様付属器は、しばしば先端で広がる不均一なフィラメントの束を含む珍しい構造を示します。これらの観察は、RBS-A 付属器がピリンサブユニットの新しいタイプの集合体を表すのか、それとも完全に異なるクラスの付属器なのかという疑問を提起します。

数百のクライオEM画像と数十のクライオET断層像の広範な調査により、多くのRBS-A特徴の構造をナノメートルに近い解像度で視覚化できるようになりました。 RBS の将来の研究は、極低温での SEM と組み合わせた FIB ミリングによって細胞を薄層に薄層化する標本作製方法に続いて、画像コントラストを劇的に高める位相板光学系によるイメージングから恩恵を受ける可能性があります 48,49。私たちのデータは、RBS-A の細胞体が crioET 実験で許容される限界よりも厚いと思われるが、RBS-A を容易に見つけるには薄すぎるため、RBS-A の薄いラメラの生成を可能にするためには crioCLEM が必要であることを示唆しています。蛍光標識なしでcryoFIBミリングの前にcryoSEMによる。 cryoCLEM+cryoFIB-SEM実験に続いてcryoETを成功させると、薄い周縁部を超えたRBS群集とその細胞体のより包括的な分析が可能になるだけでなく、サブトモグラム平均化による高解像度での関心対象の細胞内成分の可視化も可能になる可能性がある。

地球上の微生物の大多数には、孤立した代表者がいません19。配列決定に基づく解析は、上記の多様性を調査し説明するのに非常に貴重であることが証明されていますが、微生物の生物学のすべての側面を調査するために使用できるわけではありません。未培養生物の理解における注目すべき盲点には、これらの系統内で進化した独自の遺伝子と、それに対応する構造的および機能的特徴が含まれます。高度なイメージング技術を使用して微生物を視覚化すると、培養されていない系統の生物学についての洞察が得られますが、この生物学的ダークマターの包括的なビューを作成するには、多くの専門分野や技術を活用したより多面的なアプローチへの移行が必要になります59,60。

再現性を最大限に高めるために、この研究で使用した試薬とリソース、およびそれらのソースと識別子のリストを補足表 5 に示します。

口腔綿棒サンプルは、米国サンディエゴのパシフィック宇宙海軍 MMP 生物科学部門が管理するハンドウイルカ (Tursiops truncatus) から採取しました。 RBS を含む最も古いサンプルは 2012 年 4 月 1 日に収集され、最も遅いサンプルは 2022 年 3 月 24 日に収集されました。スワブサンプルは、滅菌フォームキャッチオールサンプル収集スワブ (Epicenter, WI、カタログ番号 QEC091H) を使用して取得されました。 2012 年に収集されたサンプルは、左の歯肉溝を拭き取ることによって得られました。 2018年に収集されたサンプルは、口蓋、舌、および左歯肉溝（各スワブの3つの表面すべて）をスワブすることによって取得されました。 2022 年に収集されたサンプルは、口蓋、頬側表面、または左歯肉溝から採取されました。歯肉溝の 2022 個のサンプルのうち、5 個は 20% グリセロールに保存されました。他のすべての綿棒サンプルは乾燥凍結されました。綿棒採取プロトコルは、CRC Handbook of Marine Mammal Medicine に記載されているガイドラインに準拠しました。

MMP は国際実験動物管理評価認定協会によって認定されており、実験動物の人道的な管理と使用に関する米国公衆衛生政策および動物福祉法の国家基準を遵守しています。米国国防総省の要求に応じて、MMP の動物管理および使用プログラムは、施設内動物管理使用委員会 (IACUC) および米国海軍医学外科局によって定期的に検討されています。この研究を支援するための MMP イルカの動物使用および飼育プロトコルは、MMP の IACUC および海軍医学外科局によって承認されました (IACUC #92-2010、BUMED NRD-681)。

スワブから細胞を分離するために、スワブを微量遠心管内の 1X PBS (細胞密度に応じて約 50 ～ 100 μL) に浸しました。チューブを約 10 秒間激しくボルテックスし、軽く遠心分離してチューブのキャップから液体を除去しました。得られた溶液を顕微鏡検査に使用しました。

PBS 中の約 1 μL の細胞溶液をアガロースパッド (PBS 中の 1% アガロース) 上にスポットし、100 倍 (NA: 1.4) の対物レンズを備えた Eclipse Ti-E 倒立顕微鏡 (Nikon、東京、日本) で画像化しました。 DNA 局在を決定するために、340/488 nm の発光/励起スペクトルを使用してイメージングする前に、細胞を最終濃度 0.5 μg mL-1 の DAPI で 5 分間染色しました。位相差顕微鏡によるイルカ口腔サンプルのハイスループット自動イメージングは、ひずみライブラリーイメージングプロトコル 38 を使用して達成され、2018 年に収集された各サンプルでは 226 視野、2022 年に収集されたサンプルでは 100 視野がキャプチャされました。

グラム染色は、グラム染色キット (Sigma Aldrich、カタログ番号 77730-1KT-F) を使用して、製造業者のプロトコールに従って実施した。細胞は、100倍の対物レンズを備えた明視野顕微鏡(Nikon)を使用して画像化された。 FM4-64 色素 (ThermoFisher Scientific、カタログ番号 T13320) を、メーカーのプロトコルに従ってイルカの口腔綿棒サンプルに直接適用しました。 FM4-64 色素は RBS のどの部分も染色しませんでした。

細胞の PBS 溶液 (2.5 µL) を、グロー放電した 200 メッシュの銅、ホーリーカーボン Quantifoil グリッド (Quantifoil、Großlöbichau、ドイツ、カタログ番号 Q2100CR1) または金 GridFinder Quantifoil グリッド (Quantifoil、Großlöbichau、ドイツ、 Cat. #LFH2100AR2) を使用し、続いて 2 µL の 15 nm 金基準溶液を各グリッドの両側に塗布します。グリッドを 5 秒間ブロットし、EM GP プランジフリーザー (Leica、Wetzlar、ドイツ) を使用して、液体窒素で約 -195 °C に冷却した液体エタン中でプランジ凍結しました。

サンプルは、エネルギーフィルター (スリット幅 20 eV) を使用して 300 kV で動作する Titan Krios G3、またはエネルギーフィルターなしで 300 kV で動作する Titan Krios G4 の 2 つの顕微鏡のいずれかにロードされました。両方の顕微鏡には、顕微鏡写真を記録するために使用される K2 Summit 直接電子検出装置 (Gatan、プレザントン、米国) が装備されていました。データは、SerialEM (v. 3.8)61 を使用して計数モードで半自動的に取得されました。 CryoEM/ET イメージングパラメーターを補足表 6 に示します。

モンタージュは、IMOD v. 4.12.9 の「blendmont」アルゴリズム 62 を使用して 4 倍以上ブレンドおよびビニングされ、EMAN2 v. 2.3963 を使用して表示目的のために正規化、バンドパスフィルター処理、回転、トリミングが行われました。 16 の傾斜シリーズのうち 15 は、IMOD v. 4.12.9 での断層撮影再構成に適していました。 7.5 Å ピクセル -1 でサンプリングされたチルトシリーズは 2 倍ダウンサンプリングされ、3.48 または 3.75 Å ピクセル -1 でサンプリングされたチルトシリーズは 4 倍ダウンサンプリングされました。過剰な帯電、ドリフト、高傾斜時に忍び寄る大きな氷の汚染、または高傾斜時の過剰な厚さなどのアーティファクトを含む画像は、手動の金基準ベースの位置合わせの前に、12 枚の傾斜シリーズから除外されました。元の生のチルトシリーズの 41 枚の画像から最大 13 枚の画像が削除されました。

断層像は、標準的な加重逆投影と SIRT のようなフィルター (16 回の反復を模倣) を使用して再構成され、特徴のアノテーション、セグメンテーション、ムービー作成、およびその他の表示目的のために、ほとんどの場合バンドパスフィルター処理され、さらに 2 倍にビニングされました。。断層像の厚さは、目に見える RBS-A または氷の汚染密度を持つ最小および最大の Z スライスを視覚的に識別し、スライスの数をナノメートルに変換することによって推定されました。 EMAN2 v. 2.3964,65 を使用して、リボソームであると疑われる球状密度、外膜下のマトリックス密度、周期的表面被覆のパッチ、および線毛様付属器の領域に対してサブトモグラムの平均化を試みましたが、~ より優れた解像度で解釈可能な構造はありませんでした。５０Åが得られた。線毛様付属器の厚さと長さの範囲は、断層像のスライスを視覚的にスキャンして、肉眼で知覚できる最も薄い個々のフィラメントと最も厚い束を見つけ、測定ツールを使用してビンごとに 4 分割された断層撮影スライスでそれらの寸法を測定することによって導出されました。 EMAN2のテープツールe2display.py。周期的表面被覆の繰り返し距離は、断層撮影スライスからの線毛様付属器と同様の方法で手動で測定され、3 つの断層像のそれぞれから約 10 ～ 20 の測定値があり、繰り返しが識別可能な少なくとも小さな領域が表示されました。この定量化により、約 6 ～ 10 nm の範囲が得られました。これは、層の構成要素が柔軟であるか、または下にある構造がスライスされた角度に応じてサブユニット間の見かけの距離が異なる可能性があることを示唆しています。さらに、高倍率のモンタージュ二次元投影画像でパターンがより明確に示されている領域が切り取られ、水平面内に位置するように回転され、フィルタリングされ、マスクされて、外膜に平行な線密度プロファイルが計算されました。

最初に、EMAN2 の半自動 2 次元ニューラルネットワークベースのパイプライン 66 を使用して、3 つの断層像に対して 3 つの特徴 (周期的な表面被覆、脂質膜、および線毛様付属物) の断層撮影アノテーションを実行し、UCSF で偽陽性の手動クリーンアップを実行しました。キメラ v. 1.1667。 EMAN2 v. 2.39 からの出力アノテーション確率マップは、視覚的に決定されたしきい値を適用し、コントラストを反転した断層像にしきい値処理されたアノテーションマップを乗算することによってセグメンテーションに変換されました。セグメンテーションは EMAN2 v. 2.39 でローパスフィルター処理され、ノイズが除去されました。ただし、半自動アノテーションでは細胞内構造の複雑さが捉えられなかったため、同様のプロセスを適用して、手動で 5 つの特徴 (線毛様付属器、周期的表面被覆、外膜、基質、内膜) のセグメンテーションを生成しました。アノテーションは、手動アノテーションの効率を向上させる最近のプロトコルに従って、IMOD v. 4.12.9 で実行されます68。 RBS-A 特徴をカラーで表示する図 6 のスナップショットと、セグメンテーションの結果を示す補足ムービー 2 および 3 は、UCSF Chimera v. 1.16 で作成されました。

まず、光学顕微鏡を使用して RBS-A を含むグリッドを特定しました。 Aquilous CryoFIB (ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州、米国) を使用して、30 kV、30 pA の電流、5 μs の継続時間を使用して 5 つのラメラを作成しました。次に、サンプルの観察とデータ収集のために、サンプルを cryoTEM にロードしました。ラメラ内の RBS を確認できませんでした。

無菌大腸菌 MG1655、非無菌 Skeletonemacostatum LB 2308 (米国テキサス州オースティン、テキサス大学オースティン校の UTEX 藻類培養コレクション)、Caulobacter crescentus CB15N、および Simonsiella muelleri ATCC 29453 の細胞培養を対照として調製しました。大腸菌はLBブロスで培養し37℃で増殖させ、S.コスタタムはエルドシュライバー培地で20℃で約12時間の明期と約12時間の暗周期で培養し、C.クレセントゥスはPYE培地で30℃で培養した。 °C、S. muelleri を BSTSY 培地 (2.75% (w/v) トリプシン大豆ブロス、0.4% (w/v) 酵母エキス、10% ウシ血清) 中で 37 °C で培養しました。

すべての FISH プローブは、Integrated DNA Technologies (米国コーラルビル) に HPLC 精製で注文しました。プローブ配列および蛍光標識は次のとおりです: Euk-1209: 5'-GGGCATCACAGACCTG-/3Alx660/-3'、Bact338: 5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-/Alx488/-3'、BET42a: 5'-/Alx594/-GCCTTCCCACTTCGTTT- 3'、GAM42a: 5'-/Alx488/-GCCTTCCCACATCGTTT-3'、非EUB: 5'-/Cy5/-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3'。

コントロールおよび RBS-A からの細胞を微量遠心分離管に収集しました。イルカの口腔スワブから十分なバイオマスを確保するために、4 つのスワブからの細胞が 1 つのチューブに凝縮されました。 FISH プロトコルは参考文献から採用されました。 69. 細胞を 1 mL の 3.7% ホルムアルデヒド溶液 (800 μL の DEPC 処理水、100 μL の 10X PBS、100 μL の 37% ホルムアルデヒド) 中で 700 rpm で穏やかに振盪しながら 30 分間固定しました。次いで、細胞を１ｍＬの１ＸＰＢＳで２回洗浄し、３００μＬのＤＥＰＣ処理水と７００μＬの２００プルーフエタノールの混合物中で７００ｒｐｍで２時間穏やかに振盪しながら透過処理した。プローブを、プローブセット当たり最終濃度１μＭとなるように５０μＬのハイブリダイゼーション溶液に添加した。 BET42a および GAM42a の場合、ハイブリダイゼーション溶液には 55% ホルムアミド溶液 (4 mL の DEPC-水、1 g のデキストラン硫酸、4.85 mL のホルムアミド、1 mL の 2X SSC、DEPC 処理した総量 10 mL とした) が含まれていました。水）; 他のプローブの場合、ハイブリダイゼーション溶液には 40% ホルムアミドが含まれていました (5 mL の DEPC-水、1 g のデキストラン硫酸、3.53 mL のホルムアミド、1 mL の 2X SSC、DEPC 処理水で合計 10 mL に調整) 。 BET42a および GAM42a の場合、細胞をプローブとともに 50 μL のハイブリダイゼーションバッファー中で 46 °C で 1 時間インキュベートしました。他のプローブの場合、細胞を 50 μL のハイブリダイゼーションバッファー中で FISH プローブとともに 30 °C で一晩インキュベートしました。細胞を洗浄溶液（２ｍＬの２０×ＳＳＣ緩衝液、７．０６ｍＬのホルムアミド、１０．９４ｍＬのＤＥＰＣ処理水）を使用して２回洗浄し、２×ＳＳＣ緩衝液に再懸濁した。イメージングのために、1 マイクロリットルの細胞を、PBS および 5 μg mL-1 の DAPI を含む 1% アガロースパッドにマウントしました。画像データは FIJI v. 2.0.070 を使用して処理されました。

16S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定のために 54 頭のイルカの口腔サンプルが選択されました。ゲノム DNA は、メーカーの指示に従って DNeasy UltraClean 96 Microbial Kit (Qiagen Cat. #10196-4) を使用して、イルカの口腔サンプルと 32 個の陰性 (PBS) 対照から抽出されました。 16S rRNA V4 領域は、Platinum™ II HotStart PCR Master Mix (ThermoFisher Cat. #14000013) を使用し、515F および 806rB プライマーを使用して増幅されました。 PCR産物を等量プールし、ゲル精製しました。最終精製は、Macherey-Nagel NucleoSpin Gel および PCR Clean-up、ミニキット (Fisher、カタログ番号 740609) を使用して実行されました。アンプリコンは、Stanford Chan Zuckerberg Biohub Facility の 250 bp ペアリードを使用して Illumina MiSeq プラットフォームでシーケンスされ、リード深さの中央値は 92,077 リード (最小: 50,772、最大: 265,108) となりました。

逆多重化は、Bcl2Fastq v. 2 (Illumina、CA、USA) を使用して実行されました。 ASV は、「ビッグデータワークフロー」(https://benjjneb.github.io/dada2/bigdata_paired.html) のガイドラインに従って、DADA271 v. 1.16.0 を使用して推論されました。分類学的所属は、SILVA 138 SSU データベース 72 を参照として使用して割り当てられました。順方向読み取りと逆方向読み取りは、それぞれ 240 nt と 180 nt にトリミングされました。このパイプラインにより、54 サンプル全体で合計 1,116 分類群と 5,339,751 読み取りが得られました。 ASV は、phyloseq v. 1.28.072 を使用して分析されました。

当社の DNA 抽出、増幅、配列決定、およびバイオインフォマティクス分析パイプラインがナイセリア科のメンバーを識別できたことを確認するために、スパイクイン実験を実行しました。我々はまず、位相差顕微鏡検査によって RBS-A を含むイルカの口腔サンプルを選択しました。次に、このサンプルの 2 つのアリコートを作成しました。最初のアリコートに、S. muelleri 純粋培養からの細胞を 1:1 の比率でスパイクしました。他のアリコートはそのまま放置した。これら 2 つのサンプルは、S. muelleri 純粋培養のアリコート (陽性対照) とともに、上記の DNA 抽出、PCR 増幅、および配列決定プロトコールを受けました。 3 つのサンプルは 1 回の Illumina MiSeq 実行でシーケンスされましたが、この研究の他のアンプリコンサンプルと同じレーンにはありませんでした。陰性対照サンプルと同じ実験室環境で S. muelleri を PCR 増幅し、同じレーンで配列決定することにより、ある程度の相互汚染が予想されることに注意してください。初めてネガティブコントロールサンプルの配列を決定したとき（実験室にS. muelleriの純粋培養物が存在しない場合）、ナイセリア科アンプリコンは検出されませんでした。

RBS-A の候補となるアイデンティティを取得するために、ミニメタゲノミクスアプローチを採用しました。外来 DNA による汚染を制限するために、参考文献のガイドラインに従って、試薬、チューブ、および PBS を 11.4 J cm-2 の紫外線で処理しました。 72. RBS-A は、40 倍の対物レンズとホフマン変調光学系を備えた Olympus IX70 倒立顕微鏡 (Olympus、Waltham、USA) を使用して視覚化されました。 SAS-10 マイクロインジェクターを備えた Eppendorf TransferMan マイクロマニピュレーター (Eppendorf、ハンブルク、ドイツ、カタログ番号 5193000020) を使用して、Polar Body Biopsy マイクロピペット (30° の角度が付けられ、面取りされ、内径 13 インチで研磨されている) で RBS-As を捕捉しました。 15 μm) (Cooper Surgical、デンマーク、マロフ、カタログ番号 MPB-BP-30)。 RBS-A または RBS-A の連鎖を取得した後、マイクロピペットチップを 1X PBS を含むコレクションチューブに移し、RBS-A が確実にチューブ内に沈着するようにチューブ内で押しつぶしました。 RBS-As がガラス製マイクロピペットに頻繁に張り付いて取り除くことができなかったため、この予防策が採用されました。イルカ細胞は捕捉されませんでしたが、サンプルからの無細胞DNAと小さな非標的細胞は、RBS-Aが他の種に付着する傾向に基づいて、RBS-Aとともに汚染物質として取得された可能性があります（図5e）。 4 本の RBS-A チューブ (サンプル名 RBS1 ～ 4) を 4 本のネガティブコントロールチューブ (NEG1 ～ 4) とともに収集しました。陰性対照は、目に見える細胞を含まず、それ以外の点ではＲＢＳ－Ａ含有サンプルと同様に処理した同じサンプルから採取したＰＢＳから構成された。

各チューブからの DNA は、製造業者のプロトコールに従って、Repli-g シングルセルキット (Qiagen、ヒルデン、ドイツ、カタログ番号 150343) を使用して、MDA を介して増幅されました。 DNA は Zymo Clean and Concentrate Spin Column (Zymo Research Corporation、米国アーバイン、カタログ番号 D4013) を使用して精製し、ライブラリーは Kapa Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems、米国ウィルミントン、カタログ番号 KK8504) を使用して調製しました。イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校の比較機能ゲノミクスのための WM Keck センター。 8 つのライブラリーは、Illumina MiSeq 2 × 250 nt P2 V2 プラットフォームを使用して配列決定されました。 RBS-A サンプル RBS1、RBS2、NEG1、および NEG2 は単一レーンでプールおよびシーケンスされ、11,371,243 リードペアが生成され、サンプル RBS3、RBS4、NEG3、および NEG4 は 1.5 レーンでプールおよびシーケンスされ、合計 19,615,690 リードペアが生成されました。シーケンスアダプターは Keck Center で計算によって削除されました。

8 つすべてのサンプルからの読み取りは、SPAdes v. 3.11.173 を使用して、単一セル (-sc) モードと慎重 (-careful) モードを指定してコアセンブリされました。合計 61,973,866 リードペアがアセンブリに使用され、その結果、全長 17,438,233 bp、長さ 5 kbp のスキャフォールド 1,406 個、長さ 5 kbp 以上のスキャフォールドの N50 は 14,592 となりました。タンパク質をコードする遺伝子は、Prodigal v. 2.6.274 を使用して同定されました。足場ごとの平均カバレッジは、bowtie2 v. 2.2.475 を使用してサンプルごとのリードを共アセンブリに対してマッピングし、samtools v. 1.6 の深さ関数 76 を使用して塩基ごとのリードカバレッジを計算し、カスタムスクリプトを使用して塩基ごとの平均を計算することによって計算されました。足場ごとのカバレッジを読み取ります。

ミニメタゲノミクス実験から回収されたビン内の amiC2 遺伝子の検索は、HMMER suite v. 3.1b277 を使用して、各ゲノムのタンパク質配列に対して Pfam アライメント PF01520 をクエリすることによって実行されました。

配列決定された細胞の分類学的同一性を決定するために、ゲノム分解アプローチを採用しました。ゲノムビンへの足場の割り当ては、参考文献に記載されているように、5 kbp のウィンドウにわたって 5 kbp 以上の長さのすべての足場のテトラヌクレオチド頻度を使用して実行されました。 78. 結果は、Databionics ESOM Tools ソフトウェア v. 1.179 を使用して計算および視覚化され、18 のゲノムビンの再構築につながりました (補足図 3)。ビンを改良するために、キーの 50% 未満がビンに割り当てられている足場を削除しました。長さが 5 kbp 未満の足場はビン化されませんでした。ビンごとの完全性と汚染は、CheckM v. 1.0.780 を使用して評価されました。配列決定されたゲノムの代表的なビニングがどのように行われたかを評価するために、我々は、すべてのゲノムに存在すると想定される 16 個の細菌のシングルコピー遺伝子 (bSCG) のセットをメタゲノムアセンブリで検索することにより、回収されると予想される原核生物のゲノムの数を推定しました。単一コピー81、すなわちリボソームタンパク質 L2、L3、L4、L5、L6、L14、L15、L16、L18、L22、L24、S3、S8、S10、S17、および S19。これらのタンパク質のアラインメント (PF00181、PF00297、PF00573、PF00281、PF00347、PF00238、PF00828、PF00252、PF00861、PF00237、PF17136、PF00189、PF00410、PF00338、PF0) 0366、および PF00203) は Pfam データベース 82 (2019 年 3 月にアクセス) から取得されました。 HMMER スイート v. 3.1b277 を使用してデータセットに対してクエリを実行しました。各 bSCG の中央数は 10 であり、約 10 の原核生物ゲノムがシーケンスデータセットに含まれていることを示唆しています。目的のアルカリゲナ科ゲノムの場合、16S rRNA 遺伝子は足場の端から手動で伸長されました。 bowtie2 v. 2.2.4 を使用して、読み取りが最終シーケンスをサポートしていることを確認しました。

16S/18S rRNA 遺伝子が確実に増幅/配列決定/組み立てられず、ゲノムが部分的でデータセット内に系統発生的に有益な bSCG がほとんど存在しないため、ビンの分類学的同定は課題となっていました。したがって、BLAST v. 2.2.3083を使用して、10-10のe値を使用してNCBI非重複タンパク質データベースに対して各ゲノムのすべてのタンパク質コード遺伝子をクエリし、最も近いタンパク質の一致に基づいて分類学的割り当てが行われました。上位の BLAST ヒットの 50% 以上が単一の分類群に由来する場合、ゲノムビンの分類学的割り当ては可能性が高いと見なされ、上位の BLAST ヒットの 50% 未満で 33% 以上が単一の分類群に由来する場合は、妥当であると考えられます。

サンプル中にビンが「存在する」かどうかを評価できるアプローチは多数あり、それぞれのアプローチにはほぼ任意のしきい値が設定されています。我々は、各ビンの長さを説明し、異なる数のリードペアを持つサンプル間の比較を可能にするため、サンプルごとの各ビンの相対的な存在量（補足表4）に焦点を当てました16。

アルカリゲノム科の最尤系統発生は、16S rRNA 遺伝子（補足図4a）とリボソームタンパク質S3（補足図4b）を使用して推定され、ミニメタゲノミクス実験から回収されたビン16の分類学的所属を確認しました。遺伝子/タンパク質配列は、NCBI システムでそのような配列が利用可能な場合に、NCBI 分類ブラウザー (2022 年 8 月にアクセス) に示されているように、アルカリゲナ科の特徴付けられた属ごとに取得されました (一部の属はゲノム表現が乏しいかまったくありません)。さらに、nr/nt および nr データベース (2022 年 8 月にアクセス) に対して、bin 16 16S rRNA 遺伝子と rpS3 タンパク質の BLAST83 v. 2.2.30 クエリをそれぞれ実行し、最も類似した配列の上位 10 位を含めました。 16S rRNA 遺伝子配列は、SILVA SSU データベースリリース 138.1 を参照として使用し、SINA84 v. 1.2.11 を使用してアラインメントされ、>3% のギャップを含む列または <50% の配列を含む行が削除されました。 Clustal Omega85,86 v. 1.2.4 を使用して rpS3 タンパク質配列をアラインメントし、>5% のギャップを含む列または <50% の配列を含む行を削除しました。両方の系統発生は、スマートモデル選択 88 (16S rRNA 遺伝子の場合は GTR+R、rpS3 タンパク質の場合は Q.yeast+G+I) を使用して実行されたモデル選択で、1000 回のブートストラップ複製を含む PhyML87 v. 3.1 を使用して推定されました。樹木は iTOL89 v. 6 を使用して視覚化されました。

RBS を含むことが確認された 4 つのイルカの口腔サンプルが培養作業のために選択されました。各サンプルについて、口腔スワブサンプルを含む 1.5 mL エッペンドルフチューブに 1 ミリリットルの滅菌 PBS を加えました。液体培養の場合、600 μL の各サンプルを 3 mL の BSTSY90 (2.75% (w/v) トリプシン大豆ブロス、0.4% (w/v) 酵母エキス、10% ウシ血清)、SHI91、または mSHI 培地に接種するために使用しました。 (SHI には 0.9 g/L NaCl、2.5 g/L K2PO4、0.84 g/L NaHCO3、0.17 g/L CaCl2、0.04 g/L MgCl2・6H2O、および 5 g/L ブドウ糖が補充されました)。 BSTSY は、さまざまな哺乳動物の口腔からの細菌 (特に S. muelleri) の培養に成功するために選択されました 90。 SHI が選択されたのは、この培地がヒトの口腔微生物叢に由来する多様性の高いコミュニティを維持するように設計されているためです。 mSHI (改変 SHI) は、イルカの口腔内で見られる可能性のある状態をさらに模倣することを目的として、SHI の高塩分バージョンとして組み込まれました。接種は、嫌気チャンバー（COY Lab Products、グラスレーク、米国）内の嫌気条件下で繰り返されました。すべてのサンプルは培養前に必然的に大気中の酸素に曝露されたことに注意してください。イルカの体温を模倣するために、培養物を 37 °C でインキュベートしました。約24時間、約48時間、約72時間、および約96時間後に顕微鏡下で視覚的にスクリーニングしたところ、液体培地中にRBSは検出されませんでした。固体表面培養では、約 103 ～ 104 個の細胞 (RBS-A を含むことが顕微鏡で確認された) を BSTSY または BHI 血液 (5% 羊血液を補充した BHI 培地) 寒天プレートに直接播種し、37 °C でインキュベートしました。または酸素なしでそれぞれ。 3週間のインキュベーション後、BSTSYプレート上ではコロニーは成長しませんでした。 BHI 血液プレート上で増殖したコロニーを顕微鏡を使用してスクリーニングしたところ、RBS は観察されませんでした。対照的に、BSTSY プレートに画線した S. muelleri のコントロールは、37 °C で酸素とともに 1 ～ 2 日間インキュベートした後に目に見えるコロニーを発達させ、そのコロニーが S. muelleri に期待される形態を持つ細胞で構成されていることが顕微鏡で確認されました。

この記述的研究の探索的性質を考慮すると、RBS を特徴付けるためのほとんどの実験は 1 回で実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

このプロジェクトの配列データは、NCBI BioProject PRJNA174530 から入手できます。アンプリコン調査の生のリードは SRA に寄託され、BioSamples SAMN32739817-69 および SAMN19012476 に関連付けられています。スパイクイン実験のデータは BioSamples SAMN32869723-5 に関連付けられています。単一細胞ゲノミクス実験の生のリードも SRA に寄託されました。捕捉された RBS とネガティブコントロールは、BioSample SAMN19012476 で表される単一の口腔スワブから物理的に得られたものですが、8 つの実験反復 (4 つの RBS、4 つのネガティブコントロール) からの読み取りは、それぞれ個別に BioSample SAMN19022663 ～ SAMN19022670 に関連付けられています。単一細胞ゲノミクス実験から得られた長さ 5 kb 以上の足場の共同アセンブリは、ヒト由来の配列を除去した後、DDBJ/ENA/GenBank にアクセッション JAHCSF000000000 で全ゲノムショットガンプロジェクトとして寄託されました。この文書で説明されているバージョンは JAHCSF010000000 です。単一細胞ゲノミクス実験からのゲノムビン 2 ～ 5 および 7 ～ 18 は、ホールゲノムショットガンプロジェクトとして、DDBJ/ENA/GenBank にアクセッション JAGYHI000000000-JAGYHX000000000 として寄託されました。この文書で説明されているバージョンは JAGYHI010000000-JAGYHX010000000 です。ゲノムビン 1 (ヒト) は寄託されませんでした。ゲノム bin6 (<100,000 ヌクレオチド) の足場は、受託番号 MZ126582-MZ126593 で非ゲノム GenBank への登録として寄託されました。この研究で使用された公開データセットとデータベースは次のとおりです。SILVA SSU データベースリリース 138.1 は、ASV に分類学的アイデンティティを割り当てるための参照として使用されました。 NCBI nr/nt、nr、および分類データベース (2022 年 8 月にアクセス) を使用して、Alcaligenaceae 科の属の代表について 16S rRNA 遺伝子配列 (n = 77) およびリボソームタンパク質 S3 配列 (n = 63) を取得しました。これらの配列の NCBI アクセッション番号は、補足図で入手できます。それぞれ4と5。最後に、Pfam82 データベースから取得したアライメントを使用して分析を実行しました。 Pfam アライメント PF01520 を使用して、AmiC2 タンパク質のゲノムビンを検索しました (2022 年 8 月にアクセス)。次の Pfam アライメントを使用して、16 個の細菌のシングルコピー遺伝子を検索しました (2019 年 3 月にアクセス): PF00181、PF00297、PF00573、PF00281、PF00347、PF00238、PF00828、PF00252、PF00861、PF00237、PF17136、 PF00189、PF00410、PF00338、PF00366 、PF00203。

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洞察力に富んだ議論をしてくれたレルマン研究室のメンバー、それぞれレーザーキャプチャマイクロダイセクションとマイクロ流体工学を使用してRBS-Asをキャプチャする試みを支援してくれたキャサリン・ンとブライアン・ユー、グラム染色の支援をしてくれたメリッサ・クラーク、周期表面の分析をしてくれたマイケル・シュミットに感謝します。 RBS-As、特にイルカの経口サンプルを収集するカリフォルニア州サンディエゴの米海軍海洋哺乳類プログラムのセレステ・パリーとその同僚について取材している。この研究は、NIH 助成金 P41GM103832 (WC)、James S. McDonnell Postdoctoral Fellowship (HS)、オーストリア科学基金 (TV、SB)、およびスタンフォード大学の Thomas C. and Joan M. Merigan Endowment (DAR) によって支援されました。。 KCH と DAR はチャンザッカーバーグバイオハブ調査員です。

ナターシャ・K・デュデック

現在の住所: クアントリ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、02142、米国

ミーガン・メイヤー

現在の住所: ハーバード大学医学部生物化学および分子薬理学部門、ボストン、マサチューセッツ州、02115、米国

スタンフォード大学医学部医学部、スタンフォード、カリフォルニア州、94305、米国

ナターシャ K. デュデック & デビッド A. レルマン

生態学および進化生物学部、カリフォルニア大学サンタクルーズ校、サンタクルーズ、カリフォルニア州、95064、米国

ナターシャ・K・デュデック

スタンフォード大学生物工学部、スタンフォード、カリフォルニア、94305、米国

ジーザス・G・ガラズ＝モントーヤ、ハンドゥオ・シー、クリスティーナ・ダニタ、ゴンハー・ウー、カーウィン・ケイシー・ファン、ワー・チウ

スタンフォード大学医学部微生物学および免疫学部、スタンフォード、カリフォルニア州、94305、米国

Handuo Shi、アリアナ・I・セリス、カーウィン・ケイシー・ファン、ワー・チウ、デヴィッド・A・レルマン

クライオEMおよびバイオイメージング部門、SSRL、SLAC国立加速器研究所、メンローパーク、カリフォルニア州、94025、米国

ミーガン・メイヤー & ワー・チウ

機能進化生態学部門、環境細胞生物学グループ、ウィーン大学、ウィーン、オーストリア

トビアス・ヴィーベック & シルビア・ブルゲレジ

オーストリア、ウィーンのウィーン大学、微生物学および環境システム科学センター、およびウィーン生態進化学博士課程微生物生態学部門

トビアス・フィーベック

スタンフォード大学医学部産婦人科、スタンフォード、カリフォルニア、94305、米国

バリー・ベア

チャン・ザッカーバーグ・バイオハブ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、94158、米国

カーウィン・ケイシー・ファン & デヴィッド・A・レルマン

退役軍人局パロアルト医療システム感染症セクション、パロアルト、カリフォルニア州、94304、米国

デビッド・A・レルマン

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概念化: NKD、KCH、DAR 方法論と調査: NKD、JGG-M.、HS、MM、CD、AIC、G.-HW、TV、SB、BB、KCH、WC、DAR 正式な分析: NKD、JGG-M .、HS、CD 視覚化: NKD、JGG-M.、HS、CD 執筆—原案: 原稿は主に NKD と JGG-M によって書かれました。 NKD の原案に基づいており、他のすべての著者による改訂が加えられています。執筆 - レビューおよび編集: すべての著者。監修：KCH、WC、DAR

デビッド・A・レルマンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Brian Hedlund と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Dudek、NK、Galaz-Montoya、JG、Shi、H. 他イルカの口内のこれまで特徴づけられていなかった長方形の細菌構造。ナットコミューン 14、2098 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37638-y

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受信日: 2021 年 11 月 1 日

受理日: 2023 年 3 月 23 日

公開日: 2023 年 4 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37638-y

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