構造

Nature Communications volume 13、記事番号: 7724 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細菌の形質転換における重要なステップは、グラム陽性菌の厚いペプチドグリカン細胞壁、またはグラム陰性菌の外膜と薄いペプチドグリカン層を通ってペリプラズムに DNA が取り込まれることです。 この取り込みステップには、形質転換可能な細菌に広く保存されている DNA 結合タンパク質である ComEA が必要です。 今回我々は、2つのグラム陽性菌種、Bacillus subtilisとGeobacillus stearothermophilusに由来するComEAのX線結晶構造を決定し、グラム陰性菌には存在しないドメインを同定した。 X線結晶学的、遺伝的および分析的超遠心分離（AUC）分析により、このドメインがComEAオリゴマー化を促進することが明らかになり、これが形質転換に必要であることが示されました。 我々は、多波長 AUC (MW-AUC) を使用して、DNA と ComEA DNA 結合ドメイン間の相互作用を特徴付けます。 最後に、我々は ComEA DNA 結合ドメインと DNA の相互作用のモデルを提示し、ComEA のオリゴマー化がグラム陽性菌の厚い細胞壁を横切る DNA の取り込みを促進する引張力を提供する可能性があることを示唆しています。

形質転換のための自然な能力は、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方、および一部の古細菌に広く普及している水平遺伝子伝達のメカニズムです (総説については 1、2 を参照)。 形質転換プロセスは、取り込みと輸送という 2 つの主要なステップで構成されます (図 1A)。 取り込みは、グラム陽性菌の厚いペプチドグリカン細胞壁、またはグラム陰性菌の外膜と薄いペプチドグリカン層を通って、ペリプラズムへの環境変換 DNA (tDNA) の移動です。 輸送は、その後の一本鎖 tDNA のペリプラズムから細胞質への移動であり、そこで染色体と再結合して形質転換体を生成することができます。 ここで紹介する構造機能研究は、最初のステップである DNA の取り込みに焦点を当てています。

A tpilus は ComGC で構成されており、そのアセンブリには ATPase ComGA が必要です。 tpilus は膜タンパク質 ComGB に固定されていると考えられています。 tpilus は DNA に弱く結合し、DNA をペリプラズムに引き込むために収縮します。 ここで、DNA は ComEA と出会い、細胞への結合を安定させ、DNA の継続的な取り込みを推進します。 ComEC は、DNA の 1 本の鎖を分解し、DNA を細胞質に輸送するためのチャネルを提供すると提案されています。 B 代表的なグラム陽性菌である枯草菌由来の ComEA のドメイン構造。 代表的なグラム陰性菌、コレラ菌由来の ComEA の C ドメイン構造。 残基 1 ～ 24 は、ペリプラズム内で自由に拡散する成熟 ComEAVc を生成するために切断される予測分泌シグナルを構成するという事実を強調するために示されていません。 TM、予測膜貫通領域。 マゼンタの線は、この研究で取り上げられる未知の機能の領域を示しています。 うーん、ヘリックス、ヘアピン、ヘリックスのモチーフ。 残基番号付けは ComEAB または ComEAVc に対応します。 図の要素は BioRender.com で作成されました。

tDNAが形質転換線毛（tpilus）と相互作用すると、細胞表面で取り込みが開始されます。 tpilus とのこの接触に続いて、広く保存されているペリプラズムタンパク質 ComEA との相互作用によって、tDNA のペリプラズムへの移動が促進されます (図 1A)。 ComEA は、枯草菌の形質転換欠損の遺伝子スクリーニングで発見されました。 その後、これは細胞への tDNA の安定した結合と tDNA の取り込みの両方に必要な非特異的 DNA 結合タンパク質であることが示されました 3,4。 B. subtilis およびその他のグラム陽性菌では、ComEA は N 末端膜貫通領域によって膜に結合しています4。 この膜アンカーと C 末端 DNA 結合ドメインは、約 110 個のアミノ酸からなる機能不明の領域によって隔てられています (図 1B)。 顕著な対照的に、グラム陰性菌の ComEA には、ペリプラズム内に自由に拡散する単一の (独立した) DNA 結合ドメインのみが含まれています 5、6、7 (図 1C)。

ヘリコバクター ピロリ 8 を除くグラム陰性菌と陽性菌の両方において、DNA に結合して収縮する 4 型線毛によって取り込みが開始され、形質転換する DNA のセグメントがペリプラズム コンパートメントに引き込まれます 9,10。 グラム陰性コレラ菌や淋菌では、単一ドメイン ComEA がこの導入された tDNA セグメントに結合し、外膜を横切る逆方向拡散に​​よる tDNA の損失を防ぐことが提案されています 6,11。 したがって、線毛は取り込みを開始し、ComEA はブラウンラチェット 12 として機能し、tDNA の大部分をペリプラズムに取り込むための推進力を提供します。 すべての細菌では、ペリプラズムへの取り込み後、tDNA の 1 つの鎖が分解され、残りの鎖が ComEC 膜チャネルを通って細胞質に輸送されます (1、2 で概説)。 グラム陽性菌では、膜結合型 ATP アーゼ ComFA とそのパートナータンパク質 ComFC が輸送のためのエネルギーを提供すると考えられます。 同等のグラム陰性タンパク質は同定されていません。

グラム陽性菌における ComEA の複雑な構造と膜固定は、コレラ菌や淋菌で提案されている単純なブラウンラチェット機構とは異なる作用を示す可能性を示唆しています。 この複雑な構造を調査し、その作用機序についての洞察を得るために、我々は枯草菌タンパク質を中心とした in vitro および in vivo の構造機能研究を実施しました。 今回我々は、B. subtilis (ComEAB) と Geobacillus stearothermophilus (ComEAG) 由来の ComEA の X 線結晶構造を、相補的な遺伝学的および生物物理学的解析とともに紹介します。 これらの研究により、DNA結合ドメインが異型のヘリックス-ヘアピン-ヘリックスドメインであることが明らかになり、最も重要なことに、これまで同定されていなかったドメインが機能不明のグラム陽性ComEA領域内に存在することが明らかになった。 我々は、このドメインが ComEA のオリゴマー化を促進し、オリゴマー化が遺伝子形質転換に必要であることを示します。 DNA取り込みにおけるComEAオリゴマー化の予期せぬ役割は、グラム陽性菌の厚い細胞壁を横切るtDNA取り込みの原動力となるDNA-タンパク質の凝縮によって説明されると我々は仮定する。

ComEAの機能について機構的な洞察を得るために、ComEABとComEAGのX線結晶構造をクローニング、過剰発現、精製し、それぞれ3.20Åと3.05Åの分解能で決定しました（図2A、2B、および表S1）。 ComEABs DNA結合ドメインまたはリンカー領域の電子密度は明らかではありませんでしたが、以前に記載されていないドメイン（アミノ酸60〜122）に対応する明らかな密度がありました（図2A）。 ComEABs 結晶学的非対称ユニットにはこれらのドメインが 7 つ頭から尾まで配置されており、この領域をオリゴマー化ドメイン (OD) と名付けました (図 2A)。

A) ComEAB の X 線結晶構造。 7 つのプロトマーを含む 1 つの非対称ユニットが示されています。 ここでの矢印は、非対称ユニット内の 6 つの多量体化界面のうち 3 つだけを指しています。 B) ComEAG の X 線結晶構造。 2 つのプロトマーを含む 1 つの非対称ユニットが示されています。

ComEAB とは対照的に、ComEAG 構造では、OD (アミノ酸 62 ～ 124) だけでなく、非対称単位あたり 1 つの DNA 結合ドメイン (アミノ酸 143 ～ 207) にも対応する解釈可能な電子密度があり、これには 2 つの OD が含まれていました。プロトマーは再び頭から尾まで配置されました（図2B）。 どちらのプロトマーにも ComEAG リンカー領域 (アミノ酸 125 ～ 142) に対応する解釈可能な電子密度がないため、非対称単位 OD ダイマーのどの OD モノマーが単一のモデル化された DNA 結合ドメインに接続しているかは不明です。 実際、ComEAGs 構造の DNA 結合ドメインをモデル化できたのは、それが偶然に結晶接触を行ったからにすぎません。 ComEAの構造から、リンカードメインは柔軟であり、ODとDNA結合ドメイン間の接触は最小限であり、ODは溶液中で多量体を形成する可能性があると結論付けています。

OD 多量体化が非対称単位を超えて広がっていることに注目します (図 2A、B)。 より具体的には、ComEABs構造では、7員の非対称ユニットがOD多量体化界面を使用して、結晶学的二重軸の周りに14員の頭部から尾部までの環を形成します（図3A、B）。 同様に、ComEAGs 構造では、対称合致関係を調べると、2 員の非対称ユニットが OD 多量体化界面を利用して結晶学的ねじ軸に沿ってキンクリング螺旋を形成し、1 回転あたり 12 個の頭から尾までのプロトマーを含むことが明らかになりました (図 1)。 3C、D）。 ComEAGプロトマー間のわずかな傾き（図S1）はComEA二量体間結合に最小限の影響を与えますが、それによりComEAGは結晶内で閉じたリングではなくねじれたリングを形成します。

A および B それぞれ ComEAB の結晶リングの正面図と側面図。 CおよびDは、それぞれComEAGの結晶学的キンクリングの正面図と側面図です。 E ComEAGs 多量体化界面の概略図。 ComEA 鎖 A と B は、それぞれ青色と茶色の結合として示されています。 水素結合は緑色の破線で示されています。 疎水性接触は、半円と球から放射状に伸びる線として描かれています。 回路図は LigPlot+50 で作成されました。

ComEAオリゴマー化界面のアミノ酸は保存されており（図S2）、ComEAプロトマーのODドメイン、たとえば分子間塩橋を形成するComEAG Arg85およびAsp113（ComEAB Arg83およびAsp111に対応）の側鎖間の顕著な分子間相互作用を媒介します。図３Ｅ）。 これは、ComEA が結晶中だけでなく溶液中でもオリゴマー化する可能性があることを示唆しており、我々はこの可能性の探索を進めました。

両方の ComEA X 線結晶構造で観察された OD が溶液中での可逆的な自己会合を媒介していることを確認するために、沈降速度分析超遠心分離 (SV-AUC) を使用してさまざまな濃度の ComEAG を分析しました。 10.3 μM では、ComEAG の大部分の沈降係数は 1.6 S であり、ComEA モノマーと一致しています。 しかし、157 μM では、ComEAG の大部分の沈降係数は 2.2 S であり、質量作用の関数として可逆的な二量体化が示唆されています (図 4A)。 中間濃度 31.3 μM では、単量体と二量体の両方が観察され、沈降速度データを個別の単量体-二量体平衡モデル 13 に当てはめることができ、Kd は 33.8 μM となりました (95% 信頼区間: 19.3 μM、48.4 μM ）（表S4）。 インビボでの ComEA の拡散は細胞膜内の 2 次元に限定されているため、見かけの ComEA 二量体化親和性は、そのインビボ二量体化親和性を過小評価している可能性があります。

10.3 μM (赤) および 157 μM (緑) の ComEAGs と 11.3 μM (青) および 124 μM (黒) の ComEAGs-A108Y の二量体化ポテンシャルを比較する積分沈降係数分布の重ね合わせ。 高濃度では ComEAGs のみが二量体化しますが、ComEAGs-A108Y は単量体のままです。 B 12.7 μM (マゼンタ) および 196 μM (オレンジ) での ComEAG OD の積分沈降係数分布の重ね合わせ。可逆的な自己会合を示します。 C チェーン A が漫画として描かれ、チェーン B が表面として描かれた ComEAG の構造。 ComEAG 鎖 Ala108 は Tyr に変異しており、マゼンタの棒で示されています。

ComEAGのSV-AUC分析と一致して、ODのみからなる短縮型ComEAGタンパク質(ComEAGs-OD)も溶液中で多量体化した(図4B)。 ただし、ComEAGs-ODは、低濃度（12.7μM）では主にモノマーとダイマーを形成し、高濃度（196μM）では最大分子量が約100kDaのより大きなオリゴマーを形成しました（図S3）。 同様の濃度での ComEAGs と ComEAGs-OD の異なる多量体状態について考えられる動態学的説明の 1 つは、ComEAGs DNA 結合ドメインの存在により OD 多量体化探索が遅くなり、衝突が制限され、その結果 OD 多量体化速度 (kon) が遅くなるということです。

ComEA の多量体化が OD によって促進されていることを確認するために、X 線結晶構造を調べて、OD 多量体化界面に埋もれた小さなアミノ酸を特定しました。このアミノ酸をより大きなアミノ酸に置き換えることで、立体バルクを導入し、多量体化を破壊できます。 我々は、ComEAG Ala108（ComEAB Ala106に対応）を同定し、それをチロシンで置換しました（図3E、4A、C、およびS4）。 実際、ComEAGs-A108Yは、11.3μMおよび124μMの両方で単量体であった(図4A)。 これらの SV-AUC 実験は、X 線結晶構造から予測されるように、OD が溶液中で ComEA の多量体化を促進することを示しています。

我々はさらに、ComEA の多量体化が DNA との相互作用において重要な役割を果たしていると推測しました。 これをテストするために、多波長分析超遠心分離 (MW-AUC)14、15、16、17 を使用して、野生型 ComEAG および ComEAGs-A108Y の DNA への結合を測定しました。 MW-AUC は、独自の吸光度スペクトルに基づいてタンパク質と DNA 種のスペクトル分離を可能にする新しい技術です。 その結果、形成された錯体のモル化学量論を測定し、各流体力学種を形成する高分子の種類を特定することが可能になります。 流体力学的測定は、各種のモル質量と流体力学的半径に依存します。

ComEA と二本鎖 DNA の間の相互作用を解明するために、野生型および変異型 ComEA を 14 bp 二本鎖 DNA 二本鎖と 5:1 および 10:1 のタンパク質過剰モル比および 10:1 タンパク質過剰量で混合しました。 40 bp の二本鎖 DNA 二重鎖上にあります (図 5A ～ C および表 S2)。 すべての場合において、DNA 濃度は 1.5 μM で一定に保たれ、溶液中に遊離した DNA は 10% 未満で、明確に定義された複合体が形成されました。 デコンボリューションされた DNA 沈降パターンは、すべての場合において形成されている飽和した均一な複合体の存在を示唆しています。 予想通り、DNA は完全に占有されるまで過剰なタンパク質を隔離し、14 bp 配列に収容される ComEA 分子の数は 40 bp 配列よりも少なくなりました。

A および B 野生型 ComEAG および ComEAG-A108Y と 14 bp DNA 分子のそれぞれ 5:1 および 10:1 モル比の混合物。 ここで、DNA シグナルは依然としてタンパク質による完全な飽和を示唆していますが、タンパク質シグナルはより不均一な沈降係数分布を示しており、これはタンパク質-DNA 複合体との交換がより迅速であることと一致しており、これはより速い koff 速度を示唆しています。 DNA の 90% 以上がタンパク質と複合体を形成しており、パネル A では 14 bp DNA 分布がコントロール単独の 2.0 S から変異体の 3.3 S、野生型の 3.9 S にシフトしています。パネル B では、DNA の分布が増加しています。タンパク質濃度を 10:1 にすると、野生型の DNA 沈降はさらに約 4.0 S にわずかにシフトしますが、変異体と混合した場合には DNA 沈降にほとんど影響を与えません。 C ComEAG と ComEAGs-A108Y と 1.5 μM の 40 bp DNA 分子の 10:1 混合物からのデコンボリューションされたタンパク質および DNA シグナルの積分沈降係数分布のオーバーレイ。 DNA の存在下で結合していない ComEA は、DNA の非存在下で ComA と共沈殿します。 ここでも、DNA シグナルの 90% 以上が、3.3 秒の遊離 40 bp DNA の位置から、変異型では 6.3 秒、野生型では 8.1 秒で均質な組成にシフトしており、DNA が ComEA で飽和していることが示唆されます。 ComEA シグナルは DNA シグナルを厳密に追跡しており、koff 速度が遅い緊密な複合体形成を示唆しています。 すべてのプロットにおいて、各分子の参照対照は円で示されています (ComEA: 赤丸、ComEA-A108Y: 青丸、14 または 40 bp DNA、示されているように: 緑丸)。DNA と野生型タンパク質間の相互作用の記号は次のとおりです。四角形（ComEA シグナル：オレンジ色の四角形、DNA シグナル：濃い緑色の四角形）で示され、ComEA-A108Y と DNA 間の相互作用は三角形（ComEA-A108Y シグナル：オリーブ色の三角形、DNA シグナル：水色の三角形）で示されています。

複合体の沈降係数は野生型と変異体で異なり、DNAの長さに依存しました。 14 bp 二本鎖 DNA 二重鎖は、単独では 2.0 S で沈降しましたが、5:1 混合物中で ComEAGs-A108Y との 3.3 S 複合体、および野生型 ComEAG との 3.9 S 複合体を形成しました (図 5A)。 この混合物について、ComEAGs で形成された複合体についてはタンパク質:DNA 比が約 3:1、ComEAGs-A108Y タンパク質と形成された複合体については約 2:1 の比率が測定されました。 10:1 タンパク質:DNA 混合物の場合、ComEAGs-A108Y ではわずかに大きな 3.5 S 複合体が形成され、野生型 ComEAG では 4.0 S 複合体が形成され、タンパク質:DNA 比は大きく変化しませんでした (図 5B)。 。

40 bp DNA は、単独で検査すると 3.3 S で沈降しますが、ComEAGs-A108Y と 10:1 の比率で混合すると 6.3 S 複合体が得られ、野生型 ComEAG と同じ混合物では 8.1 S 複合体が得られました。 (図5C)。 40 bp DNA の場合、形成された複合体のタンパク質:DNA モル比の差は、野生型と変異体の間でより顕著でした。 野生型 ComEAG は約 7:1 の比を示しましたが、DNA と ComEAGs-A108Y との複合体は約 4.7:1 の比の存在を示唆しました。 これらの比率の精度は、形成された複合体の推定モル吸光係数に依存しますが、野生型タンパク質と変異タンパク質の DNA に結合する ComEA の量には明らかな違いがあります。

まとめると、これらの結果は、オリゴマー化する能力のある野生型 ComEA が、A108Y 変異体よりも DNA とより大きな複合体を形成することを示唆しています。 オリゴマー化は、DNA 上での ComEA の効率的かつ協調的なパッキングを促進し、これはゲル シフト分析 (以下に詳述) によってさらに裏付けられます。

ComEA ODドメイン自体と、重要なことに、多量体化界面に埋もれた残基の両方がグラム陽性細菌で保存されていることから（図S2および3E）、ODが形質転換に重要であるという仮説が立てられました。 我々は、野生型 ComEAB を含む菌株における B. subtilis 形質転換を比較することにより、これを in vivo で測定しました。 ComEABs-D111N、D111とR83の間の保存された分子間塩橋を破壊します（ComEAGのAsp113およびArg85に対応、図3E）。 ComEABs-A106Y（ComEAGs-A108Yに対応）。上に示したように、OD多量体化を立体的にブロックします（図4A、C）。 ComEA-ΔODは、膜貫通領域とDNA結合ドメインの両方を無傷のままにしながら、OD全体の欠失を含みます。 野生型 ComEAB と比較して、ComEABs-D111N は B. subtilis の形質転換をほぼ 100 倍減少させました (図 6A)。 さらに顕著だったのは、枯草菌の形質転換を約1,000倍減少させるComEABs-A106YおよびComEA-ΔOD変異であり、これは完全なcomEA欠失の表現型と同等である。 ウエスタンブロット分析により、野生型および変異型ComEAタンパク質が枯草菌において同様に発現されることが示された(図6B)。 A106Y オリゴマー化欠損変異体がペリプラズムへの DNA の取り込みを妨げることによって形質転換に影響を与えるかどうかを調べるために、ペリプラズムに取り込まれるが細胞膜を通過できないローダミン標識 tDNA を使用しました 18。 (図 6C) に示すように、A106Y 変異は、ペリプラズムへの取り込みが必要であることを以前に示したコンピテンス発現細胞との安定した DNA 結合を妨げます 18。 我々は、ComEA のオリゴマー化が B. subtilis の形質転換において、そしておそらく他のグラム陽性菌の形質転換において予期せぬ必要な役割を果たしていると結論づけています。

すべての変異は、comG のプロモーターから発現されるシアン蛍光タンパク質 (CFP) をコードする配列のコンピテンス特異的融合を保持する BD9007 の染色体に導入され、異所性 amyE 遺伝子座に配置され、コンピテンス発現細胞の同定を可能にしました。落射蛍光顕微鏡検査。 形質転換実験は生物学的三重実験として実施し、野生型値に対して正規化した平均頻度をデータ点を含めてパネルAに棒グラフとしてプロットした。 野生型コントロールのデータ ポイントの数が多いことは、3 つの生物学的複製すべてにこの株が含まれていることを反映しています。 変異体の標準偏差を伴う平均正規化値は、0.0012 ± 0.00047 (ΔOD)、0.0.0005 ± 0.00024 (A106Y)、0.11 ± 0.03 (D111N) でした。 p 値は、両側 t 検定を使用して決定されました。 パネル B は、抗 GFP 抗血清を使用した、対応する野生型および変異抽出物のウェスタンブロットを示します。 ΔcomEA 抽出物は、ComEA シグナルの同一性のコントロールとして含まれました。 パネル C は、ローダミン標識ラムダ バクテリオファージ DNA で 45 分間形質転換した後の、野生型 (BD9007) およびその同質遺伝子型 A106Y 変異体同等物からの典型的な落射蛍光画像を示しています。 コンピテンス発現細胞はCFP蛍光(擬似シアン色)によって同定され、検出可能な細胞関連ローダミン-tDNAシグナルは丸で囲まれている。 野生型では、42 個の細胞のうち 13 個の細胞が少なくとも 1 つの赤い点を示しましたが、23 個の変異細胞では、かろうじて検出可能な細胞関連ドットが 1 つだけ観察されました。 下のパネルにある大きな赤い斑点は細胞とは関係なく、原因不明の蛍光物質の混入によるものです。 画像左下のスケールバーは 1 ミクロンに相当します。 パネル B および C の顕微鏡検査とウェスタンブロット実験をそれぞれ 3 回繰り返し、非常に類似した結果が得られました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

ComEAG の X 線結晶構造により、OD の構造だけでなく、ComEA DNA 結合ドメインの三次元形状も明らかになりました。 配列分析から予測され、以前に述べたように 6、ComEA DNA 結合ドメイン構造には 2 つのヘリックス-ヘアピン-ヘリックス (HhH) モチーフが含まれています (図 1B および 7A)。 標準的な HhH 含有タンパク質の構造は、HhH モチーフのペアが通常 α ヘリックスによって接続されており、これら 5 つのヘリックスを合わせて (HhH)2 ドメインと呼ばれることを示しました 19。 HhH モチーフを接続するこのリンカーヘリックスは ComEA には著しく欠如しており、その 2 つの HhH モチーフは代わりにループによって接続されています (図 7B)。 したがって、ComEA DNA 結合ドメインは、コネクターヘリックスを使用せずに、よく折りたたまれたコンパクトな DNA 結合コアを形成する、典型的な HhH ドメインです。

A 形質転換研究に使用された 4 つのグラム陽性菌 (上) およびグラム陰性菌 (下) によって発現された ComEA タンパク質の HhH モチーフのアラインメント。 突然変異誘発のために選択された 4 つのリジン残基が赤色で強調表示されます。 二次構造の割り当ては ComEAG の結晶構造から得られました。 B dsDNA (棒として示す) と複合体を形成した ComEAGs DNA 結合ドメイン (円柱として示すα-ヘリックス) のモデル。 HhH1 と HhH2 を接続するループは緑色で表示されます。 水素結合は黒い破線で示されています。 明確にするために、ComEAG は、精製に使用される 15 bp ではなく、複合体の中心となる 8 bp の複合体で示されています。 C HhH モチーフ変異体の形質転換頻度。 形質転換実験は生物学的三重実験として実行され、野生型 (BD9007) 値に対して正規化された平均頻度がデータ ポイントを含む棒グラフとしてプロットされます。 変異体の標準偏差を伴う平均正規化値は、0.0054 ± 0.004 (K164A)、0.23 ± 0.066 (K193A)、0.54 ± 0.22 (K197A)、0.0031 ± 0.0025 (K199A) ​​でした。 p 値は、両側 t 検定を使用して決定されました。 Dは、抗GFP抗体を使用して得られた野生型および変異型ComEAタンパク質のウェスタンブロットを示しています。 このウェスタンブロット実験は合計 3 回繰り返され、ほぼ同じ結果が得られました。 E 野生型 ComEAG、ComEA-K166A、および ComEA-K201A の EMSA 分析。 EMSA 分析を少なくとも 2 回繰り返しましたが、ほぼ同じ結果が得られました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

ComEA-DNA相互作用を調査するために、Dali20およびHADDOCK 2.421を使用してComEAGs-DNAモデルを生成しました（図7B）。 HhH ドメインが DNA と相互作用する典型的な方法である、タンパク質骨格の窒素と DNA リン酸基との間の多数の水素結合に加えて、Lys166、Lys195、および Thr196 の側鎖が DNA リン酸基と水素結合を形成していることを観察しました。 DNA結合およびComEA機能に対するComEA側鎖相互作用の重要性を理解し始めるために、我々はComEABの対応する界面残基の一部(例、ComEAB K164およびK193)をアラニンに変異させ、枯草菌における形質転換に対するそれらの影響を試験した(図1)。 7C）。 さらに、実験的に決定されたComEA-DNA構造が存在しないため、インシリコモデルが不完全である可能性を考慮しました。 たとえば、ComEA-DNA モデルは、ComEA のオリゴマーが DNA に結合するときに発生する可能性のある ComEA DNA 結合ドメイン間の相互作用の可能性を示していません。 したがって、我々は追加の ComEAB 残基 K197 および K199 (ComEAG 残基 K199 および K201 に相当) をアラニンに変異させ、枯草菌における形質転換に対するそれらの効果をテストしました。

ComEABs 変異体 K164A、K193A、K197A、および K199A を B. subtilis の染色体から個別に発現させ、形質転換に対するそれらの効果を野生型 ComEA の効果と比較しました (図 7C)。 ウェスタンブロット分析により、野生型ComEABおよびHhHモチーフに変異を含むComEABタンパク質が同様のレベルで発現されることが示された(図7D)。 これらのインビボ研究はまた、K193AおよびK197Aの再現可能な2〜4倍の効果とは対照的に、K164AおよびK199A変異が形質転換において2対数を超える減少を引き起こすことを示した(図7C)。

ComEAGs-DNA モデルでは、残基 K166 (ComEABs K164 に相当) が DNA と接触します。 この観察および in vivo での形質転換における ComEABs-K164 の機能喪失 (図 7C) と一致して、電気泳動移動度シフト アッセイ (EMSA) を使用して測定したところ、精製 ComEAGs-K166A (図 S4) は DNA に結合しません (図 7C)。 .7E）。 対照的に、ComEAGs-DNAモデルでは、残基K201(ComEABs K199に相当)はDNAと接触しない(図7B)。 しかし、ComEABs-K199Aはインビボで機能喪失を示し(図7C)、精製された同等のComEAGs-K201A(図S4)は、インビトロでの見かけのDNA結合親和性の約2倍の減少しか示さなかった(図7C)。 .7E）。 ComEAGs 残基 K201 (ComEABs 残基 K199) は、ComEA 分子が DNA に結合するとき、または ComEAGs-DNA モデルでは明らかではない DNA 結合相互作用に関与するときに、ComEA 分子間の相互作用を媒介する可能性があると考えられます。

ComEA-DNA複合体内のComEA-ComEAおよびComEA-DNAの分子間相互作用の詳細を具体化するには追加の構造研究が必要となるが、ComEABs K164が中心的な役割を果たしているようである。 我々の研究で評価したすべての残基の中で、ComEABs K164 はグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方にわたって最もよく保存されています (図 7A および S2)。 実際、それは ComEA において HhH モチーフの特徴的な残基と少なくとも同じように保存されています。 同等のコレラ菌残基K63は、その生物体において重要な役割を果たすことがBlokesch研究室によって示され、インシリコモデリングでは、我々の研究でそうであると思われるように、それがDNA6と接触する可能性があることが示唆された（図7B）。

DNA結合にとって重要な残基を正確に特定することに加えて、野生型ComEAGおよびK201A変異タンパク質とのEMSA（図7E）は、DNAに結合したComEA分子間のOD-OD相互作用と一致して、協力性の証拠を示した。 中間濃度のタンパク質分子では、完全にシフトした DNA と、シフトしていないプローブおよび部分的にシフトしたプローブが共存します。 EMSA 実験における同様の二峰性分布は、協力的な結合挙動が記録されている別の非特異的 DNA 結合タンパク質である SSB についても報告されています 23。

この研究では、いくつかの注目すべき発見が示されています。 まず、B. subtilis と G. stearothermophilus の ComEA に多量体化ドメインが存在することを実証しました。これは、グラム陽性菌によってコードされる他のマルチドメイン ComEA タンパク質でも明らかです (図 S2 および 8A)。 我々のAUCの結果は、結晶構造から推定されるオリゴマー化界面がComEAの二量化にとって重要であること、およびComEABとComEAGの両方の結晶中に環構造が存在することを確認し、また、単離されたODを用いたSV-AUC実験により、ComEAが形成される可能性があることを示しています。生体内での多量体の伸長 (図 3A ～ D、図 4B)。 MW-AUC によって決定されるように、野生型と ComEA-A108Y は異なるモル比の DNA 複合体を形成します。これは、DNA 結合がタンパク質分子を近づけることにより ComEA オリゴマー化を促進し、協力的な効果をもたらすためです。 図６Ｅに示されるＥＭＳＡの結果は、協調的なＤＮＡ結合をさらに強力に裏付けるものである。 インビボにおける ComEA の多量体化により、結晶構造で観察されるようなリングが生成されると推測したくなりますが、これに対する証拠はありません。

最後に、我々は、ペリプラズムへのDNAの取り込みには、オリゴマー化とDNA結合HhHモチーフの両方が必要であることを示した(図6および7)。 我々は以前、ComEA が B. subtilis において重要な役割を果たすことを示しました 4,18。 tDNA の形質転換可能細胞への最初の結合は、表面に露出した tpilus に対して行われますが、この結合は不安定です。 おそらく tpilus フィラメントの分解によって 9、tDNA のループがペリプラズムに引き込まれると、ComEA がペリプラズムへの DNA の取り込みを媒介するため、tDNA と細胞の会合は安定になります 18。 淋菌およびコレラ菌では、取り込みにおける ComEA の同等の役割は、DNA への結合が逆行性拡散を防ぐブラウンラチェット機構によるものであると説得力をもって考えられています 5,6,11,12,24。 さて、我々は、単純なラチェットと一致して、確かに形質転換には ComEA の DNA 結合活性が必要であるが、オリゴマー化も同様であることを示し、単なる拡散の整流よりも複雑なプロセスを示唆しています。 魅力的で検証可能な可能性は、ComEA 分子同士の相互作用および tDNA との同時相互作用により DNA-タンパク質複合体の凝縮が引き起こされ、取り込みの推進力となるということです (図 8B)。 これは、DNA と FoxA1 転写因子および FUS タンパク質との相互作用について最近報告された縮合に似ていると考えられます 25,26。どちらも DNA に結合し、自己相互作用を示します。

ComEAB には、N 末端膜貫通領域、これまで同定されていなかった OD、および C 末端 DNA 結合ドメインが含まれています。 B ComEA が OD 内の連絡先を使用して自己関連付けすることを示しました。 DNAのループをペリプラズムに持ち込むためにtpilusを収縮させた後、tDNAがComEA DNA結合ドメインに結合し、その後の取り込みにより細胞会合が安定化する一方、隣接するComEA分子への結合による遠位DNAセグメントの架橋により、入ってくるtDNAが凝縮される。 、引張力を発揮して、tDNAをペリプラズムに運びます。 図の要素は BioRender.com で作成されました。

力を生成する機械として ComEA-tDNA 凝縮を考えるには、ペリプラズム内の ComEA の幾何学的形状を考慮する必要があります。 DNA結合ドメインとオリゴマー化ドメインは20〜25残基の柔軟なリンカーによって接続されており、ODは約60残基の別のリンカーによってペリプラズム膜表面から分離されています（図8A）。 したがって、ペリプラズム内の 2 つのドメインにはかなりの自由度があります。 この移動性は、提案された凝縮メカニズムの重要な要素である可能性があり、隣接するComEA分子がそのODを介して相互に接触すると同時に、DNA結合ドメインを介してtDNAの異なるセグメントに接触することを可能にし、したがってtDNAを効果的に架橋および凝縮させることができる（図8B）。 ）。 したがって、グラム陽性菌の ComEA は単なるブラウンラチェットではなく、tDNA の取り込みのための力を生成するタンパク質として機能する可能性があると我々は提案します。

グラム陽性 ComEA 分子とグラム陰性 ComEA 分子を比較すると、2 つの疑問が生じます。なぜ ComEAB は膜タンパク質として進化したのに対し、その単一ドメインオルソログはペリプラズム内で自由に拡散できるのか、そしてなぜグラム陽性 ComEA タンパク質だけが膜タンパク質として進化したのかということです。うなずき？ 最初の疑問は、グラム陽性菌には外膜が存在しないということで答えられるかもしれません。 膜の固定により、細胞壁を通した小さなタンパク質の拡散と損失が防止されます。 実際、一部のリガンド結合タンパク質、例えば取り込みのためにアミノ酸に結合するタンパク質は、グラム陰性菌のペリプラズムでは拡散性であるが、グラム陽性菌では膜に固定されている27、28、29。 グラム陽性菌のみに OD が存在することは、グラム陰性菌と比較した表面構造の違いを反映している可能性もあります。 グラム陰性菌では、特徴的に薄い細胞壁を通る形質転換 DNA の拡散は、ブラウンラチェットがペリプラズムに効率的に侵入するのに十分な速さである可能性があります。 しかし、形質転換する DNA とグラム陽性菌の厚いペプチドグリカン内の必要なチャネルとの接触により、拡散に摩擦障害が生じ、追加の引っ張り力が必要になる可能性があります。 この直感的な概念は、チャネルが長くなるとチャネルを通る拡散速度が低下することを示す研究によって裏付けられています30。

comEA (コドン 58 ～ 205) は、Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ (New England Biolabs) および His6-BsuF および His6-BsuR プライマーを使用して、枯草菌 168 株のゲノム DNA から PCR 増幅されました (表 S2)。 増幅されたインサートを、C 末端に His6 タグが付いた pET28b の NcoI および XhoI 制限部位にクローン化し、発現ベクター pComEAB を生成しました。 pComEABで形質転換した大腸菌BL21(D3E)を、30μg/mlカナマイシンの存在下、200rpmで一定に振盪しながら、LB培地中37℃でOD0.6まで増殖させた。 次に ComEAB の発現を 0.5 mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) で誘導し、18 °C で一晩増殖させました。 次いで、細胞をペレット化し、２０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅを補充した溶解緩衝液Ａ（３０ｍＭのトリスＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）に再懸濁した。 再懸濁した細胞をフレンチプレスを使用して溶解し、溶解物を61,000×g、4℃で1時間の遠心分離によって清澄化した。 清澄化したライセートを、緩衝液Ｂ（３０ｍＭ トリスＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）で平衡化したＨｉｓ－６０樹脂（Ｔａｋａｒａ）にロードした。 樹脂を緩衝液 C (30 mM トリス HCl [pH 8.0]、300 mM NaCl、20 mM イミダゾール) で洗浄し、次に緩衝液 B で洗浄しました。残留 DNA を除去するために、樹脂を緩衝液 D (30 mM トリス HCl [pH 8.0]) でインキュベートしました。 ８．０］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２および２０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ）を室温で３０分間反応させた。 樹脂を緩衝液Bで洗浄し、タンパク質を500mMイミダゾールを含む緩衝液Bで溶出した。 タンパク質の純度は、SDS-PAGEを使用して分析しました。 ComEAB を含む画分を緩衝液 E (30 mM トリス HCl [pH 8.0]、50 mM NaCl) に対して一晩透析し、緩衝液 E で平衡化した Source 15Q カラムにロードしました。緩衝液 E と緩衝液 F の直線勾配を使用してタンパク質を溶出しました ( 20 カラム容量にわたる 30 mM トリス HCl [pH 8.0]、1 M NaCl)。 精製されたComEABを含む画分をプールし、3 kDa MWCO遠心濃縮装置を使用して濃縮した。 濃縮したタンパク質を、緩衝液Ｇ（１５ｍＭクエン酸塩［ｐＨ４．５］、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。 溶出されたタンパク質は、3 kDa MWCO 遠心フィルターデバイスを使用して濃縮され、-80 °C で保存されました。

comEA (コドン 58 ～ 205) を合成し (大腸菌での発現に最適化されたコドン (Genscript, Inc.))、pET28b にクローニングして、C 末端 His6 タグと変異 A101M および T126M を含む pComEABs-A101M、T126M を生成しました。 一晩初代培養物を、30μg/mlカナマイシンの存在下、200rpmで振盪し、1X LB中で37℃で一晩増殖させた。 細胞を4500×gで15分間遠心分離することによって回収した。 細胞ペレットをSeMETベース培地(SelenoMethionine Medium Base Plus Nutrient Mix - Molecular Dimensions)で2回洗浄し、最後に50 mg/Lセレノメチオニンを含む10 ml SeMet培地に再懸濁し、二次SeMet培地培養物を接種した。 この培養物を 37 °C で OD 0.6 まで増殖させた後、0.5 mM IPTG を添加して ComEAB 発現を誘導しました。 細胞を18℃でさらに16時間増殖させた後、4500×gで15分間遠心分離してペレット化した。 次に、セレノメチオニン誘導体化 ComEAB を、天然 ComEAB について記載したのと同じプロトコールを使用して精製しました。

comEAG (コドン 60 ～ 207) は、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) と His-Sumo-Gsth_F および His-Sumo-Gsth_R プライマーを使用して、Geobacillus stearothermophilus (ATCC 7953) のゲノム DNA から PCR 増幅されました (表 S2)。 。 ギブソンアセンブリ法(New England Biolabs)を使用して、増幅したPCR産物をpTB146ベクターのSapI部位とXhoI部位との間にクローニングした。 得られた構築物 pComEAGs は、N 末端に His-Sumo タグを持っていました。 陽性クローンは、DNA 配列決定によって確認されました。

His-Sumo-ComEAG は大腸菌 BL21(DE3) で過剰発現されました。 培養物を、100μg/mlアンピシリンの存在下、37℃でLB培地中でOD600が0.6になるまで増殖させた。 His-Sumo-ComEAG の発現は、0.5 mM IPTG を添加し、その後 18 °C で一晩増殖させることによって誘導されました。 次いで、細胞をペレット化し、２０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ（Ｇｏｌｄｂｉｏ）を補充した溶解緩衝液Ａ（３０ｍＭのトリスＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）に再懸濁した。 再懸濁した細胞をフレンチプレスで溶解し、61,000×g、4℃で1時間遠心分離して溶解物を清澄化しました。 清澄化したライセートを、緩衝液Ｂ（３０ｍＭ トリスＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）で平衡化したＨｉｓ－６０樹脂（Ｔａｋａｒａ）にロードした。 樹脂を緩衝液 C (30 mM トリス HCl [pH 8.0]、300 mM NaCl、20 mM イミダゾール) で洗浄し、次に緩衝液 B で洗浄しました。残留 DNA を除去するために、樹脂を緩衝液 D (30 mM トリス HCl [pH 8.0]) でインキュベートしました。 8.0]、150 mM NaCl、10 mM イミダゾール、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2 および 20 μg/ml DNase)、23 °C で 30 分間。 樹脂を緩衝液Bで洗浄し、タンパク質を500mMイミダゾールを含む緩衝液Bで溶出した。 タンパク質の純度は、SDS-PAGEを使用して分析しました。 次に、1.5 mg/ml His-Ulp1 を ComEAG に添加し、続いて緩衝液 E (30 mM Tris HCl [pH 8.0]、50 mM NaCl) に対して 4 °C で一晩透析することによって、His-Sumo タグを除去しました。 切断された His-Sumo および His-Ulp1 は、サンプルを新しい His-60 Ni 樹脂 (Takara) 上に通すことによって除去されました。 His-Sumoタグのない切断されたComEAGをプールし、緩衝液E(30mM Tris HCl [pH 8.0]、50mM NaCl)で平衡化したSource 15Qカラムにロードした。 タンパク質を、２０カラム容量にわたる緩衝液Ｅおよび緩衝液Ｆ（３０ｍＭ トリスＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１，０００ｍＭ ＮａＣｌ）の直線勾配を使用して溶出した。 Source 15Q 後に得られた ComEAG には依然として不純物が含まれていましたが、これらは緩衝液 E (30 mM Tris HCl [pH 8.0]、50 mM NaCl) で平衡化した 5 mL Hitrap Heparin HP カラム (Cytiva) を使用して除去されました。 タンパク質を、２０カラム容量の緩衝液Ｅおよび緩衝液Ｆ（３０ｍＭ トリスＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１Ｍ ＮａＣｌ）の直線勾配で溶出した。 純粋な ComEA を含む画分をプールし、3 kDa MWCO 遠心濾過装置で濃縮しました。 濃縮されたタンパク質を、緩衝液Ｇ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ８］、１００ｍＭ ＫＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製した。 次に ComEAG を 3 kDa MWCO 遠心フィルター装置を使用して濃縮し、-80 °C で保存しました。

comEAGs-OD (コドン 60 ～ 122) は、Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ (New England Biolabs) と His-Sumo-Gsth_F および His-Sumo-OD_R プライマーを使用して、Geobacillus stearothermophilus (ATCC 7953) のゲノム DNA から PCR 増幅されました (表) S2)。 ギブソンアセンブリ法(New England Biolabs)を使用して、増幅したPCR産物をpTB146ベクターのSapI部位とXhoI部位との間にクローニングした。 得られた構築物 pComEAGs-OD は、N 末端に His-Sumo タグを持っていました。 陽性クローンは、DNA 配列決定によって確認されました。 ComEAGs-OD は、野生型 ComEAGs について説明したのと同じプロトコールを使用して精製しました。

ComEAGs-A108Y、ComEAGs-K166A、および ComEAGs-K201A は、表 S2 に記載の変異原性オリゴヌクレオチドを使用して Q5 部位特異的変異誘発キット (New England Biolabs) を使用して生成されました。 陽性クローンはDNA配列決定によって確認された。 ComEAGs-A108Y、ComEAGs-K166A、および ComEAGs-K201A は、野生型 ComEAG について説明したのと同じプロトコルを使用して精製しました。野生型および変異体 ComEA タンパク質は同一の溶解度を示し、精製中に同様に挙動しました（図 S4）。 二量体化できないことと一致して、A108Y 変異により、緩衝液 G (10 mM トリス [pH 8]、100 mM KCl) で平衡化した Superdex200 10/300 カラム (GE Healthcare) 上で ComEAG が野生型 ComEAG よりも 0.40 ml 遅く溶出されました。上記のように。

ComEABs-A101M、T126M、および ComEABs の結晶は 2 ～ 3 日以内に出現し、1 週間以内に成熟まで成長し、1 μl の ComEABs (10 mg/ml) を等量の母液と混合することによる蒸気拡散法によって得られました。 22% PEG 500 および 0.1 M コハク酸塩を含む溶液 [pH 5.5]、20 °C。 次いで、１０％グリセロールを補充した同じ母液溶液を使用して結晶を凍結保護した。

X 線データは、スタンフォード シンクロトロン放射光源 (SSRL) ビームライン 14-1 で Blu-Ice 5 を使用し、MAR モザイク 325 CCD 検出器を使用して極低温で収集されました。 ComEABs-A101M、T126M、および ComEABs の結晶の回折データは、それぞれ 0.97900 Å および 0.97946 Å で収集されました。 データは HKL ソフトウェア パッケージを使用して処理されました31。 Autosol32 を使用して ComEABs-A101M、T126M Se 原子の位置を特定し (性能指数 = 0.36)、初期モデルが構築されました。 このモデルは、Phaser33 での分子置換を使用してネイティブ ComEAB 構造の位相を取得するために使用されました。 その後、モデルは COOT34 で手動で構築され、phenix.refine35 を使用してネイティブ回折データに対して改良されました。 改良の最初のラウンドには、シミュレートされたアニーリング、個々の原子座標、および B 因子改良が含まれていました。 その後の改良では、個々の原子座標、個々の B 因子、および TLS 改良が採用されました。 最終モデルには、残基 59- または 60-122 の電子密度が含まれていました。 工学的に開始された Met に対応する電子密度は観察されませんでした。 または ComEA 残基 58、59 (鎖 G)、123 ～ 205; または改変された C 末端 His タグ。 ComEAB のラマチャンドラン統計は、95.84% が支持、4.16% が支持、0.00% が外れ値であり、Molprobity36 を使用して計算されました。 構造の視覚化と分子グラフィックスは PyMOL37 で生成されました。

ComEAG の結晶は通常 2 ～ 3 日以内に出現し、1 週間以内に成長して成熟し、20 °C でのシッティング ドロップ蒸気拡散法によって得られました。 １０ｍｇ／ｍｌのＣｏｍＥＡＧを、３０％のＰＥＧ４００および０．１Ｍの硝酸アンモニウムを含有する等量の母液と混合した。 X 線データは、StructureStudio 2.4.6 および Riraku RAXIS-IV++ 検出器を備えた Riraku Micro/Max-007HF 回転銅陽極 X 線発生装置を使用して、室温で社内で収集されました。 ComEAG の結晶の回折データは 1.5418 Å で収集されました。 データは HKL ソフトウェア パッケージを使用して処理されました31。 初期位相は、ComEAB の部分構造を探索モデルとして使用し、Phaser33 で分子置換によって得られました。 ComEAGs モデルは COOT34 で構築され、phenix.refine35 を使用して洗練されました。 改良の最初のラウンドには、シミュレートされたアニーリング、個々の原子座標、および B 因子改良が含まれていました。 その後の改良では、個々の原子座標、個々の B 因子、および TLS 改良が採用されました。 最終モデルには、残基 62 ～ 124 (チェーン A および B) および 143 ～ 207 (チェーン A) の電子密度が含まれていました。 工学的に開始された Met に対応する電子密度は観察されませんでした。 残基 60 ～ 61、125 ～ 142、または 143 ～ 207 (鎖 B)。 ComEAG のラマチャンドラン統計は、96.76% が支持、2.70% が支持、0.54% が外れ値であり、Molbrobity36 を使用して計算されました。 構造の視覚化と分子グラフィックスは PyMOL37 で生成されました。

沈降速度実験 (SVE) では、溶液中の遠心力場における高分子の物質輸送を測定し、混合物中のすべての種の沈降特性と拡散特性を観察し、それらの部分濃度、浮力モル質量、形状係数を報告します。 超遠心分離セル内の沈降と拡散輸送は、適応有限要素法を使用して解決されるラム方程式によって記述されます 38,39。 SV 実験で得られた境界データ全体は、計算量が多く、高性能コンピューティング プラットフォーム 43 上で実行される高度な最適化ルーチン 40、41、42 を使用して、そのような解の線形結合によってフィッティングされます。 SVE は、レスブリッジ大学のカナダ流体力学センターにある Beckman Coulter Optima AUC で実行されました。 データは、単一波長または複数波長の UV 検出を使用して収集されました。 0.45 mlのサンプルを、サファイア窓を備えた二重セクターのエポン木炭センターピースに充填し、強度モードで測定しました。 すべての実験は 20 °C、10 mM Tris [pH 8]、100 mM KCl を含む緩衝液中で行われました。 ComEAGs-OD は 37 krpm で測定されました。 ComEAG と DNA は 60 krpm で測定されました。 14 bp DNA 配列を含む MW-AUC データは 55 krpm で測定され、40 bp DNA 配列を含む MW-AUC データは 43 krpm で収集されました。 MW-AUC データは 235 ～ 285 nm の範囲で 2 nm 刻みで記録され、サンプルごとに 26 の個別のデータセットが提供されました。 すべてのデータは UltraScan 4.044 を使用して分析されました。 MW-AUC データの処理については、Henrickson et al., 202214 で詳しく説明されています。簡単に説明すると、各波長からのデータは、45 で説明されているワークフローに従って、2 次元スペクトル解析 (2DSA)40 を使用して分析されました。 時間同期 SVE を生成した後、流体力学プロファイルはスペクトル的にデコンボリューションされて、タンパク質と DNA のモル吸光係数プロファイルが得られます。 緩衝液の密度と粘度の補正は、各緩衝液成分の部分濃度を使用して UltraScan で計算されました。 モル吸光プロファイルは、各タンパク質と DNA について個別の希釈系列を実行し、Genesys 10 s ベンチトップ分光光度計 (Thermo Fisher Scientific) を使用して対象のスペクトル範囲 (220 ～ 300 nm) にわたる吸光度スペクトルを収集することによって決定されました。 各吸光度スペクトルの希釈系列は、前述のように固有の吸光プロファイルに適合しました 44。 得られた固有吸光プロファイルは、ComEAGs-A108Y の場合は 280 nm で 7,450 M-1 cm-1、ComEAG の場合は 280 nm で 5,960 M-1 cm-1 の吸光係数を使用してモル濃度にスケール化されました (タンパク質配列から UltraScan によって推定) ）。 拡散補正された堆積係数プロファイルは、UltraScan46 に実装された強化されたファン ホルデ – ヴァイシェット解析を使用して生成されました。 Van Holde – Weischet の結果は、G(s) 積分分布プロットとして示され、y 軸上に沈降種の積分濃度が表示されます。 図１〜図４に示すように。 図 4 と 5 では、すべての濃度が境界信号の 0 ～ 100% の間で正規化されています。 これらの結果は、モノマー-ダイマー平衡の Kd が 10 ～ 160 μM であることを示唆しています。 ComEAG のモノマー-ダイマー平衡の解離定数を決定するために、記載されている遺伝的アルゴリズム モンテカルロ分析を使用して、中間負荷濃度 (31.3 μM、280 nm で測定) の沈降速度実験を個別のモノマー-ダイマー モデルに当てはめました。 13と42で。 詳細なフィッティング結果を表 S4 に示します。

すべての枯草菌株は最終的に実験室株 168 に由来しました。すべての場合において直接の親株は IS75 (his leumet) でした。 すべての株は形質転換によって構築され、表 S3 にリストされています。 菌株は、ご要望に応じて著者から入手可能です。

１８に記載されている大腸菌プラスミド（ｐＥＤ２２３２）をＥｃｏＲＩで切断して、ＹＦＰ－ｃｏｍＥＡ構築物を担持する３０４５ｂｐの断片を遊離させた。 このフラグメントを単離し、EcoRIで切断したpDR1664(David Rudnerからの好意で得たthr遺伝子座挿入プラスミド)にクローン化した。 このフラグメントは、comEAのプロモーター、リボソーム結合部位、および開始コドンを含むcomEAコード配列から1,500 bp上流に含まれていました。 フラグメントの残りの部分には、comEA オープンリーディングフレームの N 末端に融合した YFP 遺伝子が含まれています。得られたプラスミド pED2401 を PvuI で線形化し、IS75 に形質転換し、thr 遺伝子座に挿入します。 次いで、カナマイシン耐性カセット産生株BD9007の挿入により、天然のcomEAオープンリーディングフレームを欠失させた。

ComEAにおける突然変異は、プラスミドpED2401およびQ5部位特異的突然変異誘発キット(New England Biolabs)を使用して構築された。 変異原性オリゴヌクレオチドを表S2に示します。 comEA 読み取りフレーム全体の配列を決定することによって検証した後、正しいプラスミドを PvuI で線形化し、BD5810 に形質転換して thr に挿入しました。 最後に、ネイティブの comEA リーディング フレームを上記のように不活化しました。

0.5 μgのバクテリオファージ ラムダ DNA (New England Biolabs) を、使用した標識試薬の量が 4 分の 1 であることを除き、メーカーの推奨に従って Mirus Label-IT ローダミン TM 試薬 (Mirus Bio) で標識しました。 次いで、ＤＮＡをＧ５０ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通して処理して、過剰な標識を除去した。

ウェスタンブロッティングはセミドライブロッティングによる標準的な方法を使用して実行し、ニトロセルロースブロットはClarity Max Western ECL基質(Bio-Rad)を使用して展開しました。 画像は Bio-Rad ChemiDoc MP イメージャーで記録されました。 抗 GFP 抗体 (Thermofisher) の 1:1000 希釈液を使用して、YFP-ComEA シグナルを明らかにしました。 抽出物を調製するための培養物を適量まで増殖させ、増殖をクレット比色計で監視した。 遠心分離による回収後、濁度のわずかな違いを補うために細胞をわずかに異なる量で再懸濁し、同等の総タンパク質が各レーンにロードされるようにしました。 これらの株はすべて、非融合 YFP をコードする異所性遺伝子を保有しているため、内部ローディング コントロールがすべてのレーンに存在しました。

すべての枯草菌株は、2 段階法を使用して適格になるまで増殖させ、以前に記載されているように形質転換しました 47。 生物学的三重反復を使用して、ロイシン原栄養性を選択して形質転換頻度を決定した。

0.2μg/mlのローダミン標識バクテリオファージラムダDNAをコンピテント培養物に添加し、45分間インキュベートした。 100μlのサンプルをSpizizen塩で2回洗浄し、100μlのSpizizen塩溶液48に再懸濁した。 1μlの形質転換細胞を顕微鏡用に薄いアガロースパッド上に載せた。

画像は、Nikon Elements ソフトウェアと、100× Plan Apo 油浸対物レンズ、NA 1.40、発光ダイオード (LED) 励起源、および Orca Flash 4.0 カメラ (浜松) を備えた Nikon Ti 顕微鏡を使用して取得しました。 データ取得と画像解析には Nikon Elements を使用しました。

Dali サーバー 20 は、XPF (PDB ID 2BGW) 49 の DNA 結合構造が ComEAG の DNA 結合ドメイン (残基 143 ～ 207) に類似していることを特定しました。 ComEAGs DNA 結合ドメインを XPF にアラインメントして、15 bp の DNA と複合体を形成した ComEAGs DNA 結合ドメインの開始モデルを生成しました。 このモデルは、明示的溶媒アプローチでの柔軟な改良を使用して HADDOCK 2.4 で改良されました 21。

電気泳動移動度シフトアッセイは、わずかに変更を加えて以前に説明したように実行されました6。 簡単に説明すると、示された濃度の ComEAG と 0.5 μM 30 bp DNA を、10 mM Tris [pH 8]、100 mM KCl、2.5% グリセロール、0.5 mM エチレンジアミン四酢酸、および 1 mM MgCl2 を含む緩衝液中で室温で 15 分間混合しました。 続いて、ブロモフェノールブルーおよび２．５％グリセロールを含む０．５容量のローディングダイをサンプルに添加した。 次にサンプルを、0.5X TBE バッファー中で 4 °C で事前実行された 8% 天然ポリアクリルアミドゲルに直ちにロードしました。 ゲルを臭化エチジウムで染色し、Bio-Rad ChemiDoc MP イメージャーを使用してスキャンしました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ComEAB および ComEAG の原子座標および構造因子は、それぞれアクセッション コード 8DFK および 8DSS でタンパク質データ バンクに寄託されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。 すべての AUC データ (一次沈降速度データ、適合モデルの結果、およびレポート) は、カナダ流体力学センターの UltraScan LIMS データベースに保存されます。 データは、リクエストに応じて、UltraScan (Cölfen H、Laue TM、Wohlleben W、Schilling K、Karabudak E、Langhorst BW、Brookes E、Dubbs B、Zollars D、Rocco M、Demeler B) でサポートされているオープン ソース OpenAUC 形式で共有できます。 AUC プロジェクトを開く. Eur Biophys J. 2010 Feb;39(3):347-59. https://doi.org/10.1007/s00249-009-0438-9. Epub 2009 Mar 19. PMID: 19296095; PMCID: PMC2812709 .、https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19296095/）。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

Dubnau, D. & Blokesch, M. 天然の有能な細菌による DNA 取り込みのメカニズム。 Annu Rev. Genet 53、217–237 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Johnston, C.、Martin, B.、Fichant, G.、Polard, P. & Claverys, JP 細菌の形質転換: 分布、共有メカニズム、および発散制御。 ナット。 Rev. Microbiol 12、181–196 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Provvedi, R. & Dubnau, D. ComEA は、コンピテントな枯草菌の形質転換のための DNA 受容体です。 モル。 微生物 31、271–280 (1999)。

記事 CAS Google Scholar

Inmine, GS & Dubnau, D. ComEA は、遺伝子形質転換に必要な枯草菌の内在性膜タンパク質であり、DNA 結合と輸送の両方に必要です。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 177、3045–3051 (1995)。

記事 CAS Google Scholar

ガンゲル、H. et al. 淋菌形質転換中のインポートされた DNA と ComE DNA 取り込みタンパク質の協調した時空間ダイナミクス。 PLoS 病巣。 10、e1004043 (2014)。

記事 Google Scholar

Seitz、P. et al. ComEA は、自然に形質転換可能なコレラ菌細胞のペリプラズムへの外部 DNA の転移に不可欠です。 PLoS Genet 10、e1004066 (2014)。

記事 Google Scholar

Seitz, P. & Blokesch, M. 自然に形質転換可能なコレラ菌の外膜と内膜を通過する DNA 輸送は、空間的には連動していますが、時間的には連動していません。 mBio 5、https://doi.org/10.1128/mBio.01409-14 (2014)。

Stingl, K.、Muller, S.、Scheidgen-Kleyboldt, G.、Clausen, M. & Maier, B. 複合システムは、ヘリコバクター ピロリへの 2 段階の DNA 取り込みを媒介します。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 107、1184–1189 (2010)。

記事 ADS Google Scholar

エリソン、CK et al. DNA に結合した IV 型コンピテンス線毛の退縮により、コレラ菌の自然形質転換中に DNA の取り込みが開始されます。 ナット。 微生物 3、773–780 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

ラム、T.ら。 肺炎球菌のコンピテンス線毛は、DNA の取り込みを促進するために収縮する非常に動的な構造です。 モル。 微生物 116、381–396 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Hepp, C. & Maier, B. 形質転換中の DNA 取り込みの動態は、転座ラチェット機構の証拠を提供します。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 113、12467–12472 (2016)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Peskin、CS、Odell、GM & Oster、GF 細胞運動と熱変動: ブラウン ラチェット。 生物物理学。 J. 65、316–324 (1993)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Demeler, B.、Brookes, E.、Wang, R.、Schirf, V. & Kim, CA UltraScan による沈降速度による可逆会合の特性評価。 マクロモル。 生物科学。 10、775–782 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

ヘンリクソン、A.ら。 生体高分子混合物と相互作用の多波長分析超遠心分離。 アナル。 Biochem 652、114728 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

Horne, CR、Henrickson, A.、Demeler, B. & Dobson, RCJ 溶液中のタンパク質-DNA 相互作用を特徴付けるツールとしての多波長分析超遠心分離。 ユーロ。 生物物理学。 J. 49、819–827 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Demeler, B. 多波長分析超遠心分離を使用した溶液中の分子相互作用の測定: スペクトル分析と流体力学の組み合わせ。 Biochem (ロンドン) 41、14–18 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Gorbet, GE、Pearson, JZ、Demeler, AK、Colfen, H. & Demeler, B. 次世代 AUC: 多波長分析超遠心分離データの分析。 方法酵素mol。 562、27–47 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Hahn, J.、DeSantis, M.、Dubnau, D. Bacillus subtilis のペリプラズムへの DNA 取り込みの形質転換のメカニズム。 mBio 12、e0106121 (2021)。

記事 Google Scholar

Shao, X. & Grishin, NV ヘリックス-ヘアピン-ヘリックスタンパク質の共通の折り畳み。 Nucleic Acids Res 28、2643–2650 (2000)。

記事 CAS Google Scholar

Holm, L. タンパク質の構造比較にダリを使用。 方法 Ｍｏｌ． バイオル。 2112、29–42 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

オノラト、RV 他雲の中の構造生物学: WeNMR-EOSC エコシステム。 フロントモール生物科学。 8、729513 (2021)。

記事 Google Scholar

Doherty, AJ、Serpell, LC & Ponting, CP ヘリックス-ヘアピン-ヘリックス DNA 結合モチーフ: DNA の非配列特異的認識の構造的基礎。 核酸研究所 24、2488–2497 (1996)。

記事 CAS Google Scholar

Dubiel, K. et al. 細菌の一本鎖 DNA 結合タンパク質による共同 DNA 結合の構造機構。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 431、178–195 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Hepp, C. & Maier, B. 細菌転位ラチェット: 異なる分子実装で共有される物理原理: 細菌の分泌系が高分子の効率的な転座のためにブラウン運動にどのようにバイアスをかけるか。 Bioessays 39、https://doi.org/10.1002/bies.201700099 (2017)。

レンガー、R. et al. タンパク質と一本鎖および二本鎖 DNA の共縮合。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 119、e2107871119 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

ウズラ、T.ら。 タンパク質と DNA の共縮合による力の生成。 ナット。 物理学。 17、1007–1012 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Hediger, MA 原核生物と真核生物における溶質輸送体の構造、機能、進化。 J.Exp. バイオル。 196、15–49 (1994)。

記事 CAS Google Scholar

Saurin, W. & Dassa, E. 結合タンパク質依存性輸送システムの内在性内膜タンパク質間の配列関係: 反復遺伝子重複による進化。 タンパク質科学。 3、325–344 (1994)。

記事 CAS Google Scholar

Tam, R. & Saier, MH Jr. 細菌の細胞外溶質結合受容体の構造的、機能的、および進化的関係。 Microbiol Rev. 57、320–346 (1993)。

記事 CAS Google Scholar

Tori, S.、Misiunas, K.、Tshitoyan, V. & Keyser, UF 閉じ込め内での粒子拡散率のチャネル長依存性。 ソフトマター 17、5131–5136 (2021)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Otwinowski, Z. & Miner, W. [20] 発振モードで収集された X 線回折データの処理。 方法酵素mol。 276、307–326 (1997)。

記事 CAS Google Scholar

Terwilliger、TC et al. マップ品質のベイジアン推定を使用した構造ソリューションの意思決定: PHENIX AutoSol ウィザード。 Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 65、582–601 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

マッコイ、AJ 他フェイザー結晶解析ソフトウェア。 J. Appl Crystallogr 40、658–674 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: 分子グラフィックス用のモデル構築ツール。 Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 60、2126–2132 (2004)。

記事 Google Scholar

アダムス、PD 他。 PHENIX: 高分子構造ソリューションのための包括的な Python ベースのシステム。 Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66、213–221 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

SC ラベルら。 Calpha 幾何学による構造検証: phi、psi、Cbeta 偏差。 プロテイン 50、437–450 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

Schrodinger, LLC PyMOL 分子グラフィックス システム、バージョン 2.4。

Cao, W. & Demeler, B. ラム方程式の適応時空有限要素解を使用した分析的超遠心分離実験のモデル化。 生物物理学。 J. 89、1589–1602 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

Cao, W. & Demeler, B. 多成分反応システム向けの適応時空有限要素ソリューションを使用した分析的超遠心分離実験のモデリング。 生物物理学。 J. 95、54–65 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Brookes, E.、Cao, W. & Demeler, B. 分子量と形状が不均一な混合物の沈降速度実験のための 2 次元スペクトル解析。 ユーロ。 生物物理学。 J. 39、405–414 (2010)。

記事 Google Scholar

Brookes, EH および Demeler, B. GECCO07: 遺伝的および進化的計算カンファレンス。 361-368 (米国ニューヨーク州ニューヨーク、コンピューティング機械協会、2007 年)。

Demeler, B. & Brookes, E. 沈降実験のモンテカルロ分析。 コロイドポリマー。 科学。 286、129–137 (2007)。

記事 Google Scholar

Brookes, E. & Demeler, B. UltraScan での沈降速度実験の解析のための並列計算技術。 コロイドポリマー。 科学。 286、139–148 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Demeler, B. & Gorbet, GE In Analytical Ultracentrifugation: Instrumentation, Software, and Applications (内山 S.、有坂 F.、Stafford WF & Laue T. 編) 119-143 (Springer Japan、2016)。

Demeler, B. タンパク質を用いた沈降速度と沈降平衡実験の設計と分析の方法。 カー。 プロトック。 タンパク質科学。 第 7 章、ユニット 7 13 (2010)。

Google スカラー

Demeler, B. & van Holde, KE 非常に不均質なシステムの沈降速度解析。 アナル。 Biochem 335、279–288 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

Dubnau, D. & Davidoff-Abelson, R. 有能な枯草菌による取り込み後の DNA の形質転換の運命。 I. ドナー-レシピエント複合体の形成と特性。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 56、209–221 (1971)。

記事 CAS Google Scholar

Spizizen, J. デオキシリボ核による枯草菌の生化学的欠損株の形質転換。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 44、1072–1078 (1958)。

記事 ADS CAS Google Scholar

ニューマン、M.ら。 DNA の有無にかかわらず XPF エンドヌクレアーゼの構造は、基質認識のモデルを示唆しています。 EMBO J. 24、895–905 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

Laskowski, RA & Swindells, MB LigPlot+: 創薬のための複数のリガンド-タンパク質相互作用図。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 情報モデル 51、2778 ～ 2786 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

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X 線回折データは、スタンフォード シンクロトロン放射光源で収集されました。 SLAC 国立加速器研究所のスタンフォード シンクロトロン放射光源の使用は、契約番号 DE-AC02-76SF00515 に基づいて、米国エネルギー省科学局基礎エネルギー科学局によってサポートされています。 SSRL 構造分子生物学プログラムは、DOE 生物環境研究局、および国立衛生研究所、国立総合医科学研究所 (P41GM103393) によって支援されています。 この出版物の内容は著者のみの責任であり、必ずしも NIGMS、NIAID、または NIH の公式見解を表すものではありません。 この研究に対する支援は、国立衛生研究所助成金 R01 GM057720 (MBN および DD) によって提供されました。 分析超遠心分離実験は、カナダ 150 リサーチ チェア プログラム (C150-2017-00015、BD)、カナダ イノベーション財団 (CFI-37589、BD)、国立衛生研究所 (1R01GM120600、BD)、およびカナダ自然科学機関の支援を受けました。および工学研究評議会 (DG-RGPIN-2019-05637、BD)。 UltraScan スーパーコンピューターの計算は、NSF/XSEDE 助成金 TG-MCB070039N (BD) およびテキサス大学助成金 TG457201 (BD) を通じてサポートされました。 カナダ自然科学工学研究評議会は、奨学金助成金を通じて AH を支援しています。

微生物学、生化学、および分子遺伝学部門、ニュージャージー医科大学、ラトガース生物医学健康科学、ニューアーク、ニュージャージー州、07103、米国

イシュティヤク・アーメド、デヴィッド・ダブナウ、マシュー・B・ナイディッチ

公衆衛生研究所、ラトガース生物医学健康科学、ニューアーク、ニュージャージー州、07103、米国

ジャネット・ハーン & デヴィッド・ダブナウ

レスブリッジ大学化学生化学学部、レスブリッジ、AB、T1K 3M4、カナダ

エイミー・ヘンリクソン & ボリーズ・デメラー

グリーヘイ小児がん研究所、サンアントニオ校テキサス保健大学、サンアントニオ、テキサス州、78229、米国

ファイサル・タリク・カジャ

モンタナ大学、ミズーラ、モンタナ州、59801、米国、化学および生化学学部

ボリーズ・デメラー

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MBN と DD は研究を発案し、実験を計画し、データを分析し、資金を獲得し、すべての著者、特に BD と IAIA が精製した ComEAB と ComEAG からの貢献を得て原稿を執筆しました。 ComEA タンパク質の生化学的および X 線結晶学的研究を設計および実行しました。 ComEAのバイオインフォマティクス分析を実施。 分析されたデータ。 そして図や表を生成しました。 JH は、ウェスタンブロットを含む枯草菌形質転換研究を実施しました。 AH と BD は、AUC および MW-AUC 実験を設計および実行し、図と表を作成しました。 FTK は ComEAB を精製し、ComEAB の結晶化条件を特定し、ネイティブ ComEAB の回折データを収集しました。

David Dubnau または Matthew B. Neiditch への通信。

著者は競合する利害関係を宣言していません

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

アーメッド、I.、ハーン、J.、ヘンリクソン、A. 他。 構造機能研究により、ComEA にはグラム陽性菌の形質転換に必須のオリゴマー化ドメインが含まれていることが明らかになりました。 Nat Commun 13、7724 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-35129-0

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受信日: 2022 年 7 月 25 日

受理日: 2022 年 11 月 18 日

公開日: 2022 年 12 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35129-0

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ヨーロッパ生物物理学ジャーナル (2023)

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