高濃度のダブルエマルジョン

ISME Communications volume 3、記事番号: 47 (2023) この記事を引用

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現場の微生物生理学に関する私たちの理解は、主に、急速に成長し、容易に分離可能な微生物の生理学的特徴付けに基づいています。 標準的な実験室分離プロトコルを使用すると、成長速度が遅い新規分離株や低栄養環境に適応した生理学的性質を持つ新規分離株を取得するための微生物濃縮は、最も成長の早い種に対する固有のバイアスに悩まされます。 これらの偏りを最小限に抑え、あまり研究されていない分類群を豊かにするための新しい栽培ツールが必要です。 この研究では、二重エマルション内での単一細胞のカプセル化と増殖に基づいたハイスループットの細菌濃縮プラットフォーム (GrowMiDE) を開発しました。 私たちは、GrowMiDE がさまざまな微生物を培養し、従来のバッチ濃縮では決して観察されなかった過小評価された分類群を濃縮できることを示しました。 たとえば、二重エマルション液滴内の栄養素の私有化による急速に成長する微生物による濃縮の優勢を防ぐことで、富裕培地濃縮培養での糞便サンプルからの成長の遅いネガティブバクテリアおよびメタノバクテリアの培養が可能になりました。 成長速度と成長収量に特化した株間の競合実験では、GrowMiDE 濃縮により、共有栄養プールの競合を防ぎ、成長は遅いがより効率的な株を濃縮しました。 最後に、GrowMiDE 濃縮物から分離株を取得するための GrowMiDE と市販の蛍光活性化細胞選別 (FACS) の互換性を実証しました。 GrowMiDE + DE-FACS を組み合わせると、さまざまな微生物濃縮やスクリーニングに簡単に適用できる、有望な新しいハイスループット濃縮プラットフォームになります。

微生物生理学に関する私たちの理解は、主に純粋培養で単離された微生物を使用した研究に基づいています。 過去 140 年間にわたって新種の微生物を分離する技術には、自然条件を模倣した好ましい環境と栄養素の流れを実験室で再現し、その後、成長した新種の種を回収する試みが含まれていました。 その結果、現在の方法は本質的に、最大増殖速度 (μMax) にわずかな差がある種であっても、共通の栄養素をめぐって他の種と競合できる急速に増殖する微生物に偏っています (図 S1-S3) [1、2]。 行方不明の成長が遅い種は、自然環境に適応するための未知の生理学的戦略を持っている可能性があり、それが群集の回復力において重要な役割を果たしている可能性があります[3]。 たとえば、成長速度よりも成長効率 ​​(成長収量) が、バイオフィルム [1、2、4] や海洋地下環境 (地球のバイオマスの約 30%) を含む低栄養フラックスまたは空間構造環境における生存戦略として提案されています。 [5、6、7、8]。 さらに重要な課題は、さまざまな微生物のライフスタイル (乏栄養生物や共ピオトロフ生物など) の成長をサポートする適切な化学環境を作り出すことです。 したがって、微生物の速い増殖速度の偏りを最小限に抑える新しい培養ツールを開発することが非常に必要です。

有限な資源をめぐる競争を制限する（つまり、栄養素の民営化による）伝統的な方法は、通常、空間分離に依存しており、コロニー形成単位の絶滅までの希釈または播種が含まれます[9、10]。 しかし、これらの技術は細胞の存在量に依存しており、スループットが低く、気液界面で生育が不十分な微生物、特に嫌気性微生物の回収には役立たない[11、12]。 液滴マイクロ流体工学アプローチは、増殖に必要な試薬が正確に分配された隔離されたバイオリアクターで新規微生物を培養するための強力なハイスループット技術として登場し [10、13、14、15、16]、抗生物質耐性のスクリーニングを容易にします [13、17、 18]、および細胞活性の測定[19、20、21]。 ほとんどの微生物学的液滴アプローチでは、細胞と培地を含む水性液滴が油相内に懸濁された単一エマルション液滴が使用されます。 多くの研究は、微生物の多様性の調査 [21、22、23、24]、高品質のゲノムの取得 [25]、および機能的スクリーニング [10、13、16、18] のための単一エマルション液滴マイクロ流体工学の有用性を示しています。 単一エマルジョン濃縮技術は、増殖収量が高い株または増殖速度が遅い株の選択も実証しており、栄養民営化が濃縮結果に及ぼす影響の概念実証として機能します[26]。 しかし、単一エマルジョン液滴は下流で分析するためにカスタム機器を必要とし、ソート速度が遅く、蛍光チャネルが限られている概念実証デモンストレーションでのみソートされているため[27、28]、新しいシステムに適用するのは困難です。

ダブルエマルジョン液滴（DE）は、微生物の増殖と分離を大幅に簡素化する可能性を備えた革新的なマイクロ流体プラットフォームです [29、30、31、32]。 DE は、外側の水層内に浮遊した油殻に囲まれた内側の水性コンパートメントで構成されています (図 1B)。 外側の水性懸濁液により、DE は一般的なフローサイトメトリー装置と直接互換性があり、細胞と同様に蛍光ゲート選別 (FACS) によって DE を選別できるようになります [33]。 装置設計、界面活性剤、選別パラメーターを最適化する最近の研究により、従来の FACS 機器でハイスループット (12 ～ 14 kHz) および単一液滴精度 (>99% の純度、単一液滴回収率 70%) で DE を選別する能力が進歩しました [33, 34]。 DE 技術の現在の応用には、細胞カプセル化 [21、29]、薬物送達 [31]、タンパク質機能スクリーニング [21] などがあります。 しかし、DE は微生物の濃縮プラットフォームとしてはまだ使用されていません。

GrowMiDE プラットフォームの概略図。 4 つのシリンジ ポンプが油溶液と水溶液をカスタム マイクロ流体デバイスに送り込み、単一の微生物を直径 30 または 45 μm のダブル エマルジョン (DE) 内にカプセル化します。 DE の生成は、Amscope 立体視鏡に取り付けられた高速カメラによってリアルタイムで監視されます。 B DE 液滴の概略および代表的な明視野画像 (スケール バー = 30 μm)。 C DE にロードされた単一大腸菌 GFP 細胞 (左) および M9 + グルコース中で 24 時間増殖させた後 (右) の明視野画像と蛍光画像を結合したもの。 D 60 mM 乳酸塩および 30 mM NaSO4 上での硫酸塩還元物質 Desulfovibrio ferrophilus IS5、65 °C、50 mM グルコース上での酢酸原菌 Thermoanaerobacter kivui、乳酸生成発酵菌 Lactococcus lactis NZ9000 を含む、DE 内での多様な嫌気性菌の増殖を示す明視野顕微鏡画像。 50 mM グルコース、および 50 mM グルコース上の混合酸発酵大腸菌 MG1655。

我々は、(i) 多様な微生物生理学と互換性があり、(ii) 下流の表現型特性評価のための濃縮とその後の単離を容易にし、(iii) 通常は失われる微生物種の回復を実証するハイスループット DE プラットフォーム (GrowMiDE) を設計しました。バッチ文化の強化における競争に勝つ。 GrowMiDE プラットフォームは、個々の液滴の栄養分を民営化することで、成長速度が速いというバイアスを最小限に抑え、成長の遅い種の濃縮を促進します。 GrowMiDE を使用して、我々は、「最も望まれている」マイクロバイオーム リストからの新規 Negativicutes 種の 22 倍の増加を含む、ヒト腸内マイクロバイオームからの従来のバッチ培養と比較して、異なる群集組成の濃縮を実証しました [35]。 また、速い成長速度以外の形質、特により高い成長収量を優先することにより、GrowMiDE を新しい分類群の濃縮に適用できることも確認しました。 最後に、微生物学者のための分離ツールとしての GrowMiDE と DE-FACS の組み合わせを実証しました。 このプラットフォームは多様な生物学的システムに容易に適応でき、我々の結果は、見落とされてきた生理機能の代表的な培養物を取得するためのハイスループット DE 培養の実現可能性を実証しています。

大腸菌 MG1655 および大腸菌 GFP を、25 mM グルコースを添加した LB 寒天または M9 培地上で、37 °C で振盪しながら日常的に培養しました。 Lactococcus lactis spp cremoris WT (NZ9000) および派生変異体 ΔldhA (NZ9010) [26] を、1.5% カザミノ酸 (w/v)、26 mg/v を補充した 10 mL の既知培地 (CDM) [36] で培養しました。 L L-トリプトファン、および 50 mM グルコース、30 °C。 NZ9000またはNZ9010のスターター培養物を、それぞれDifco M17ブロス+25mMグルコース(GM17)またはGM17+5ug/mLエリスロマイシンプレートからの単一コロニーから接種した。 シュードモナス・プチダは、LB寒天またはセトリミドプレート上で日常的に培養されました。 すべての増殖曲線は、定常期のスターター培養物からの 1% 接種材料で開始されました。 DE での厳密な嫌気性菌の培養には、嫌気性 60 mL 血清バイアル中で増殖させた 20 mL の静置培養物を接種材料として使用しました。 Desulfovibrio ferrophilus IS5 (DSM no. 15579) は、60 mM 乳酸塩と 30 mM 硫酸塩を補充した改良人工海水培地 [37] で 30 °C で培養されました。 Thermoanaerobacter kivui TKV002 は、25 mM MES (遊離酸)、75 mM MES (ナトリウム塩)、13.7 mM NaCl、0.8 mM MgSO4、18.7 mM NH4Cl、1.3 mM KCl、0.1 mM CaCl2、0.7 mM を含む培地中で 65 °C で増殖させました。 KH2PO4、40 μM ウラシル、1 mL/L 微量元素溶液 SL10、1 mL/L セレン酸タングステン酸溶液、1 mM Na2S、0.5 mg/L レザズリン、および DE の異化基質として 50 mM グルコース。 便濃縮物は、37 g/L BHI ミックス (RPI)、200 mg/L トリプトファン、1 g/L アルギニン、5 mg/mL メナジオン、500 mg/L システイン HCl、 0.12 μg/mL ヘミン溶液 [38]、0.2 g/L ムチン、レサズリン。 選択された濃縮のために、mBHI には腸微生物叢培地 (GMM) [38] に添加された濃度にほぼ基づいて追加の培地成分 (mBHI+) が補充されました: 3 mM 糖類 (グルコース、セロビオース、マルトース、フルクトース)、30 mM 酢酸ナトリウム、8 mMプロピオン酸、4 mM 酪酸ナトリウム、15 mM 乳酸ナトリウム、30 mM NaHCO3。

細胞密度は、Ultraspec 2100 分光光度計 (GE Healthcare) または Tecan Infinite M1000 マイクロプレート リーダーを使用して、600 nm での光学密度 (OD600) に基づいて測定しました。 L. lactis 株のグルコースおよび発酵プロファイルは、以前に記載されているように、Agilent 1260 Infinity 高速液体クロマトグラフを使用して定量されました [39]。 L. lactis 競合実験では、GM17 (NZ9000 + NZ9010) または GM17 + 5ug/mL エリスロマイシン (NZ9010 のみ) プレートでコロニー形成単位を測定しました。 顕微鏡分析は、標準的な明視野およびFITCフィルター設定を使用して、Leica DM4000B-M蛍光顕微鏡で実行されました。

Dropception セットアップは、キャリアフェーズ用の 4 台のシリンジ ポンプ (Harvard Apparatus PicoPlus Elite)、ステレオスコープ (Amscope)、高速カメラ (ASI 174MM、ZWO)、およびデスクトップ コンピューター (HP) で構成されます。 消耗品には、PE-2 チューブ、液滴収集用のエッペンドルフまたは嫌気性バイアル、培地コンポーネント、および HFE7500 オイル + 2.2% Ionic Krytox (FSH、Miller-Stephenson) が含まれます [40]。 表 S2 には、すべての実験の詳細な水相成分が含まれていますが、簡単に説明すると、水滴コアの細胞相と内相には、通常、基礎細菌増殖培地 (LB、M9、CDM、mBHI)、0.5% BSA、および指定された異化基質または異化基質が含まれています。染料。 10% Optiprep (Sigma) を密度調整剤として細胞相に添加し、生 DE 生成中に内相と細胞相の間の相対流量が等しいことを保証しました。 細胞は、ポアソン分布に基づいて、単一細胞ローディングの細胞キャリアフェーズで OD600 = 0.05 まで希釈されました (DE の約 20% に単一細胞が含まれ、DE の約 2% に 2 細胞が含まれます)。 外側の水性担体相には、水性コアに適合する細菌増殖培地、2% Pluronix F68 (Kolliphor P188、Sigma)、および 1% Tween-20 (Sigma) が含まれていました。 嫌気性濃縮の場合、すべてのコンポーネントは嫌気性チャンバー (COY) 内で組み立てられ、すべての消耗品は使用の少なくとも 3 日前に過剰な酸素を除去するために嫌気性チャンバー内に残されました。 30 μm および 45 μm DE の滴下デバイスのマスター モールドは AutoCAD 2019 で設計され、以前に説明したようにクリーン ルームで多層フォトリソグラフィーによって製造されました [33]。 Dropception PDMS デバイスは、以前に説明したように、標準的な実験室のベンチトップで標準的な 1 層のソフト リソグラフィーによって作成されました [33]。 使用直前に、PDMS デバイスの外側チャネルと出口チャネルを Harrick PDC-001 プラズマ クリーナーで 150 W で 12 分間選択的に O2 プラズマ処理し、PBS + 2% Pluronic F68 でフラッシュし、セロハンテープで貼り付けて移しました。嫌気チャンバーまたは好気セットアップに移します。 4 つの相 (オイル、セル、内側、外側) をシリンジ (PlastiPak、BD) にロードし、PE/2 チューブ (Scientific Commodities) を介してデバイスに接続しました。 一般的な流量は、デュアルインレット 45 µm デバイスの場合は 300:100:105:6000 (オイル: セル: 内側: 外側) µL h–1、シングルインレットの場合は 275:85:2500 (オイル: 内側: 外側) µL h–1 でした。 -入口30μmデバイス。 ライブ DE 生成は、嫌気チャンバー内のステレオスコープと高速カメラを使用して監視されました。

DE-FACS は、Sony SH800 で前述のように実行されました [29、33]。 簡単に説明すると、50 μL の DE を 5 mL 12 × 75 mm 丸底 FACS チューブ (BD Biosciences) 内の 500 μL の FACS 希釈緩衝液 (PBS + 1% Tween-20) に希釈しました。 Sony SH800 での標準的な自動キャリブレーションの後、ロードする前に DE を穏やかに再懸濁し、標準的な 408 nm レーザー構成を使用して 130 µm のマイクロ流体チップ上で液滴を分析しました。 DE は、特定の FSC-H および FSF-W ゲート内で 2 ～ 3 分後に SH800 上に表示され、続いてソーティング (収量モード) が示されている場合は FITC 蛍光でゲーティングされます。 ソートのためのドロップ遅延調整は、以前に説明したように手動で調整されました [33]。 最適な滴下遅延設定は、通常、自動校正された Sony SH800 設定によって推定された設定と一致し、30 µm DE の場合、96 ウェル プレートで 50% 以上の DE 回収率を達成しました。 FACS 分析のイベント レートは 1000 イベント/秒未満に維持され、ソート レートは 50 イベント/秒未満に維持されました。 DE-FACS のゲイン設定は以前に説明されています [33]。ただし、大腸菌 GFP または SYTO 染色細胞に対してそれぞれ 32% または 40% に設定された FITC ゲインは例外です。 選別された DE を、内部コア媒体成分に基づいて浸透圧バランスのとれた外部溶液 100 μL があらかじめロードされた FACS チューブまたは 96 ウェル プレートのいずれかに配置しました。 選別された DE 集団は、Leica DM4000B-M 蛍光顕微鏡および Leica DM E 明視野顕微鏡で画像化されました。

レート対収量スペシャリストの競争結果をシミュレートするために使用された数学的モデルは、流加培養での増殖を反映するために希釈項が削除され、増殖速度論的パラメーターが実験的に決定されたものに基づいていたことを除いて、以前の Monod モデル [41、42] に基づいていました。以前に収集された単一栽培の成長傾向 [26] およびこの研究内で。 基礎モデルで使用される微分方程式と拡張された議論は補足データに含まれています。

MATLAB プログラムは、標準の明視野と FITC フィルター設定をオーバーレイ (F1C) して、ライカ DM4000B-M 蛍光顕微鏡画像 (TIFF 形式) を分析するようにカスタマイズされました。 MATLAB はまず、液滴のエッジをシャープにし、関数 findcircles を使用して各液滴の座標を特定し、各液滴の周囲をトリミングすることで各画像を処理しました。 次に、各液滴の半径に合わせたサイズの白い円形のマスクを重ねて、液滴内のピクセルのみが画像クロップに含まれるようにしました。 白いマスクの半径を調整して、余分な液滴エッジ境界を除去しました (SF5)。 次に、コードは、液滴内部の実験的に決定されたしきい値 (データは示されていません) を超えるすべてのピクセル強度を合計します。 このしきい値は、余分な黒いピクセルを除去して、大きな液滴がより高い合計ピクセル強度を返さないようにするために実装されました。 プログラムは最終的に、すべてのインデックス付き液滴とそれぞれの蛍光の合計を含むテーブルを返し、それを分析して細胞の数と蛍光を関連付けました。

gDNA は、ビーズビート処理の前に 65 °C で 1 時間のインキュベーション ステップを追加して、Qiagen PowerSoil キットを使用して便濃縮物から調製しました。 gDNA サンプルの 16 S rRNA 遺伝子アンプリコン配列決定は、ZymoBIOMICS サービス (Zymo Research、カリフォルニア州アーバイン) によって実行および分析されました。 Zymo Research は、ライブラリーの調製 (Quick-16S rRNA 遺伝子アンプリコン NGS Library Prep、D6400)、ライブラリー後の QC、Illumina MiSeq プラットフォームを使用した 2 × 300 bp ペアエンドリードのシーケンシング、および Dada2 および QIIME パイプラインを使用したバイオインフォマティクス分析を実行しました [43] 、44]。 内部標準 (ZymoBIOMICS Microbial Community DNA Standard D6305) は、品質管理手段としてライブラリー調製に含まれています。 生の読み取りとメタデータは、BioProject PRJNA852267 に基づいて SRA に送信されました。

DE での並行ハイスループット培養のために単一微生物細胞をカプセル化するために、我々は Dropception [33] マイクロ流体プラットフォームをベースとした GrowMiDE を開発しました。このプラットフォームは、シンプルなワンステップマイクロ流体デバイス、キャリアフェーズ用のシリンジポンプ、高速カメラ、および立体視鏡（図1A、図S4）。 合計直径が 30 μm または 45 μm の単分散 DE は、それぞれデバイスの形状に依存し、以下を含む ~1 kHz で生成されました: HFE7500 + 油相として 2.2% イオン性 Krytox [40]、基礎増殖培地 + 2% pluronix F68 + 1%外相として Tween-20、細胞相および内相としてそれぞれ PBS または基礎増殖培地 + 0.5% BSA + 異化基質を使用しました (図 1A、B)。 マイクロ流体デバイス内で DE を生成した後、下流のインキュベーションまたは分析のために DE を一括で収集しました (図 1B)。 確率的負荷後に DE に単一セルのみが含まれていることを確認するために、DE の 80% が空であり、セルを含む DE の 98% が単一セルのみを含む (セルキャリアフェーズでの OD600 0.05) というポアソン領域内で操作しました。 DE を 4 時間収集すると、単一細胞を含む約 4,800 万個の並行 DE マイクロリアクター培養が得られ、低存在量の種のカプセル化を増加させることができました。

DE に封入された単一細胞が増殖するかどうかを判断するために、すべての DE をバルクでインキュベートし、液滴内の微生物の増殖を明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡で評価しました (図 1C、D)。 GFP を構成的に発現する単一の大腸菌細胞を含む DE を一晩インキュベートすると、30 ～ 100 個の細胞 (約 5 ～ 7 世代) を含む DE が得られ、DE 成分によって阻害されない液滴の強力な増殖が示されました (図 1C)。 GrowMiDE は、好気性と嫌気性の両方の微生物の増殖に対応します。 Dropception セットアップは、嫌気性グローブ ボックス内で完全に操作可能です (図 S4)。 これらの能力を実証するために、大腸菌 MG1655 (混酸発酵を行う)、ラクトコッカス ラクティス spp クレモリス NZ9000 (乳酸生成発酵)、デスルフォビブリオ フェロフィルス IS5 (硫酸塩還元)、および好熱菌 Thermoanaerobacter kivui (65 °C での酢酸生成) (図 1D)。 これらの結果は、DE が多様な微生物種を培養するのに適したハイスループットプラットフォームであることを証明しています。

DE の増殖を定量化するために、蛍光顕微鏡画像から液滴ごとの強度を自動的に検出するカスタム MATLAB スクリプトを開発しました (図 S5、S6)。 GFP発現大腸菌とこの自動スクリプトを使用して、唯一の異化基質として内相にグルコースまたは酢酸塩を含むDEの増殖を分析しました（図S7A）。 DEにおける正味大腸菌-GFP増殖はバッチ培養と一致し（図S7B-D）、GrowMiDEとバッチ培養における大腸菌-GFP増殖収量が同等であることを示しています。 これらのデータを総合すると、GrowMiDE プラットフォームを使用して、さまざまな微生物種の増殖をハイスループットで培養および定量化できることが実証されています。

次に、GrowMiDE プラットフォームを使用して、混合微生物群集から細胞を培養しました。 私たちは、微生物の主要な代謝グループに関する知識 [45,46,47,48] と、多くの異なる分類群を培養できる培地条件を確立したため、特にヒトの腸内マイクロバイオームに焦点を当てました [35、49]。 具体的には、バッチ培養またはDEのいずれかで実行された微生物の濃縮を比較することにより、GrowMiDE培養が新規分類群を濃縮するかどうかをテストしました（図2A）（表S3）。 簡単に説明すると、便サンプルを均質化し、濾過し、遠心分離して大きな粒子を除去し、細胞懸濁液を単離しました。 次に、細胞懸濁液を mBHI で低細胞濃度 (OD600 ～ 0.05) に希釈し、DE あたり 1 つを超える細胞がカプセル化される可能性を最小化し、全イベントの 2% 未満に抑えました。 16 S rRNA 遺伝子アンプリコンの配列決定により、同じ基礎培地 (mBHI) であっても、GrowMiDE 濃縮物ではバッチ増殖細胞と比較して明らかに異なる微生物群集組成が明らかになりました (図 2D)。 回収された種の絶対数はバッチ濃縮と GrowMiDE 濃縮の間で有意な差はありませんでしたが (図 2B)、濃縮された ASV の固有のアイデンティティは大きく異なりました (図 2C)。 興味深いことに、GrowMiDE は独自に、腸内水素栄養性メタン生成菌 Methanobrevibacter smithii の有意な増殖 (6.0 ± 4.0%、SD、4/6 反復) をもたらし、対応する投入便コミュニティで約 0.4% から濃縮されました (図 2D、図 S8A、C)。 。 GrowMiDE 濃縮における単一分類群の最も驚くべき増加は、Negativicutes Phascolarctobacterium faecium の濃縮であり (17.8 ± 9.8%、SD、6/6 反復)、これは投入便群における相対存在量 (0.8 ± ±) と比較して 22 倍の増加でした。 0.2%、SD、n = 5)。 (図2D、図S8B、D)。 ネガティブウイルスは、独特の細胞エンベロープ構造を持つ、よく理解されていない系統群であり、腸内マイクロバイオームにおける重要な短鎖脂肪酸（SCFA）の産生に役割を果たしていると考えられています[50、51]。 P. faecium の in situ 代謝は不明ですが、その一次異化作用は二次発酵 (コハク酸からプロピオン酸へ) であると考えられています [52]。 驚くべきことに、P. faecium はヒトの便サンプルの 67% 以上に存在します [50]。しかし、分離するのが難しいため、ヒト マイクロバイオーム プロジェクトの「最も求められている」リストに掲載されました [35]。

DE での便濃縮と mBHI でのバッチ濃縮の概略図。 B 入力スツール、GrowMiDE、および一意の ASV の合計に基づくバッチ エンリッチメントからのアルファの多様性。 浮動棒プロットは平均と範囲 (n = 5 ～ 6) を表します。 C 入力スツール、GrowMiDE、および固有の ASV のタイプに基づくバッチ エンリッチメントからのベータ版の多様性。 D 入力便サンプル、GrowMiDE 濃縮物、および便細胞懸濁液からのバッチ濃縮物からの相対的な 16 S rRNA 遺伝子アンプリコンの存在量。 E 12、24、48、および 72 時間で屠殺した DE 対バッチ培養における便濃縮の時間経過からの相対 16 S rRNA 遺伝子アンプリコン存在量、および (F) M. smithii の対応する絶対 16 S rRNA 遺伝子アンプリコン存在量 (クラス: Methanobacteria）および（G）P. faecium（クラス：Negativicutes）。 図2Dの濃縮条件とサンプルの種類の詳細な説明は、表S3に概説されています。

バッチ培養では、最終的な微生物組成はほとんど 12 時間以内に確立され、人工実験室環境で最も速い種 (大腸菌や腸球菌属など) が支配的な増殖と一致しました (図 2E)。 ただし、GrowMiDE 濃縮では、時間の経過とともに M. smithii および P. faecium の徐々に濃縮され、遺伝子コピーが増加することが観察されました (図 2E–G)。 後の時点でのこれらの分類群の出現と経時的なそれらの濃縮は、非選択培地であっても、GrowMiDE プラットフォームが成長の遅い種に対する偏りを軽減し、新しい生理学の濃縮を促進したという仮説を裏付けています。

私たちは、便 GrowMiDE 培養物は、液滴間の共有栄養素の競合 (つまり、栄養素の民営化) を最小限に抑えることによって、成長の遅い分類群を強化すると仮説を立てました。 空間構造化による栄養素の民営化は、実験室の濃縮では失われるであろう速度よりも成長収量を優先する微生物を含む、群集の多様性を促進します（図S1C）。 速度と収量の専門家の間のトレードオフは、ラクトコッカス ラクティス株において十分に文書化されている [26、36] (図 3A)。 高グルコースフラックス条件下では、野生型L. lactis（NZ9000）はホモ発酵乳酸発酵により1モルのグルコースを2モルの乳酸塩に発酵させ（図S2A）、その結果、グルコース1モルあたりATP 2モルの純収量が得られます。 低グルコースフラックスの条件下では、発酵はエタノールとアセテートの形成に向けて移行し（図S2B）、その結果、グルコース1モルあたり合計3モルのATPの純増加が得られます。 この後者の発酵代謝は、L. lactis 乳酸デヒドロゲナーゼ欠失変異体 (ΔldhA、NZ9010) に閉じ込められています。 ΔldhA 株はより高い増殖収率を持っていますが、最大増殖速度が低下するというトレードオフがあります (図 3B)。 エレガントな単一エマルジョン実験では、WT 株と ΔldhA 株のカプセル化により、効率的ではあるが成長が遅い ΔldhA 株が移植全体で濃縮されました [26]。

A 混合バッチ培養または GrowMiDE 濃縮における L. lactis WT (黒) 株と ΔldhA (赤) 株の発酵経路。 B CDM + 25 mM グルコースでの L. lactis 単培養および共培養 (1:1 開始比) の増殖 (n = 3、生物学的複製、エラーバーは SEM を示す)。 C 50 mM グルコースでの L. lactis 株の混合バッチ培養における転移全体の集団の頻度。 各移入には新鮮なCDM + 50 mMグルコースへの1%接種材料が与えられ、各株のCFUは各移入で増殖したコミュニティから決定されました(n = 3、生物学的複製、エラーバーはSEMを示します)。 D 50 mM グルコースでの L. lactis 株の GrowMiDE 濃縮における移入後の細胞密度。 CDM + Ery5 プレート上の CFU/mL で測定したところ、最初の混合培養物には約 80% の ΔldhA が含まれていました。 各移入の最後に、DE を 1H,1H,2H,2H-ペルフルオロ-1-オクタノール (PFO) とインキュベートすることによってバルクで破壊し、OD = 0.05 に希釈して単一細胞ローディングを達成し、細胞を再分離しました。 - 次の転送のために DE にパッケージ化されます。 (n = 3、技術的反復、エラーバーは SEM を示します)。 各株の CFU は、相対細胞密度を決定するために移植ごとに増殖したコミュニティから決定され、バッチまたは DE 競合実験に分割する前に、最初の混合培養物には約 80% の ΔldhA が含まれていました。 すべての L. lactis の移入は 30 °C で 48 時間インキュベートされました。

DE が同様に高い増殖収量で集団を維持するかどうかをテストするために、バッチでの L. lactis WT 株と ΔldhA 株を、連続移入による GrowMiDE 濃縮と比較しました。 両株の 1:1 混合物を含むバッチ共培養の増殖速度は、より速い WT 株に似ており (図 3B)、これは、移入後の培養液の 80% 以上を WT が構成することと一致していました (図 3C)。 予想どおり、ΔldhA 株を 80% という高頻度で接種した場合でも、バッチ培養で 2 回の移植以内に WT に 0.003% 未満で負けました (図 3C) [26]。 対照的に、より遅いΔldhA集団は、移植全体にわたってGrowMiDE濃縮において維持され、さらにはWTを支配しました（移植4により99.33％のΔldhA）（図3D）。栄養素の民営化。

DE プラットフォームの有用な特徴は、従来の顕微鏡法または FACS (DE-FACS) との直接的な互換性です (図 4A) [33、34、53、54]。 ハイスループットのカプセル化と目的の液滴を選択的に単離する機能を促進するプラットフォームの開発には、ゲノム回収率の向上 [55]、抗菌感受性アッセイ [18、56]、指向性進化研究 [57] などの幅広い用途があります。 細胞を含む DE が FACS 中に蛍光を介して空の DE から正確に区別および単離できるかどうかをテストするために、DE 内で GFP を発現する大腸菌細胞をカプセル化して増殖させた後、FAC を介して細胞を含む液滴のみを単離することを試みました。 空のDEと細胞を積んだDEの異なるFACS集団がFACSによって観察され、蛍光顕微鏡測定により、選別された陽性集団の97.5％に細胞が積まれた無傷のDEが含まれていることが確認されました（図S9A）。 顕微鏡検査の結果と一致して、FACS中に前方散乱または側方散乱に基づいて空のDEと細胞を含むDEを区別することができませんでした。 また、細胞のカプセル化中に蛍光色素SYTObcを添加することで、DE-FACSが空のDEと微生物を含むDEを区別できるかどうかを評価し、遺伝的に扱いにくい種を検出および分類する可能性を切り開きました。 SYTO 色素ベースのアプローチの制限は、低濃度 (<1 μM) での種の標識の違いです [58]。 したがって、普遍的な細胞染色の可能性を高めるために、SYTO ベースの色素の混合物を含む 2.5 μM SYTObc を使用することにしました。 24時間増殖させた2.5μM SYTObcを負荷した大腸菌MG1655を含むDEから空のDEを区別するFACSゲートを同定しました（図S9B）。 細胞運動性の検出に基づく明視野顕微鏡法によって確認されたように、SYTO+ DE 集団内には 92.2% に細胞が含まれていました。 インキュベーション時間が長いと蛍光シグナルが減少します。 ただし、SYTO+ DE 集団は 48 時間でもまだ検出可能でした (図 4C)。 約 80% の空の DE を含む入力 GrowMiDE 濃縮と比較して、DE-FACS では、E.coli-GFP および E.coli + SYTObc DE を含む DE がそれぞれ 443 倍および 419 倍濃縮されました。 これらの結果は、増殖した細菌細胞を含む DE 液滴を選別するための DE-FACS の適用を示しています。

GrowMiDE に続いて DE-FACS を使用して分離株を取得する微生物濃縮の概要と潜在的な用途。 B バッチ培養または CDM + 25 mM グルコースで 48 時間の GrowMiDE プラットフォームで濃縮されたモック コミュニティにおける 4 つのグルコース異化株の相対比。 n = 3。エラーバーは SEM を示します。 C 48 時間後に 2.5 μM SYTObc でカプセル化され、その後 96 ウェル プレート上の個々のウェルに分類されたモック コミュニティを含む 30 μm DE の FACS プロファイル。 DEを破壊するために、プレートウェルに増殖培地および10μLのPFOを予めロードした。 767 のイベントが SYTO+ DE 集団 (38321 のイベント) の上位 2% 内でゲートされ、192 が増殖を評価するためにプレート上に分類されました。 D DE-FACS の下流で分離された 34 の代表的な産出株の増殖曲線。 すべての増殖アッセイは 30 °C で実行されました。

シングルエマルションマイクロ流体工学および従来の単一細胞 FACS ソーティングにおける主な障壁は、下流の表現型解析のために生細胞を単離することの難しさです。 単細胞ゲノムは細胞が死んだ場合でも下流プロセスで回収できる場合がある[59、60]が、選別された集団における細胞生存率を維持することは微生物生理の下流特性評価に不可欠である。 したがって、GrowMiDE を使用したハイスループットの微生物培養と DE-FACS を使用した下流分離は、スクリーニング、濃縮、分離のための強力なアプローチとなる可能性があります (図 4A)。 概念実証として、大腸菌、シュードモナス・プチダ、L. ラクティス WT、および L. ラクティス ΔldhA を含む合成グルコース異化コミュニティにおける GrowMiDE + DE-FACS の適用を実証しました。 合成コミュニティは、(i) 定義された培地におけるすべての種の適合性、(ii) 同等のグルコースの異化利用、および (iii) 混合培養から種の同一性を表現型的に評価するために選択的プレーティングを使用できる能力により選択されました。 純粋培養における相対増殖速度と収量が高いため、大腸菌はバッチ濃縮と GrowMiDE 濃縮の両方で優勢でした (図 S10)。 ただし、GrowMiDE 培養のみが合成コミュニティ内の 4 株すべてを保存しました (図 4B、図 S11)。 最大増殖速度のわずかな低下でさえ、バッチ培養で種の損失を引き起こす可能性があることを示しており、P.プチダは、単一培養で2番目に高い増殖率と収量を持っていたにもかかわらず、48時間後にバッチ培養競争で頻繁に失われました（図S10）。 GrowMiDE 濃縮の場合、SYTO+ DE 集団 (図 4C) から個々の DE を 96 ウェル プレートに選別し、PFO を含む DE からカプセル化されたクローン集団を放出し、回収された分離株の増殖測定値を収集しました。 ここでは、細菌の染色強度が低下し、結果としてより広いFACSゲートが得られたにもかかわらず、すべての株がDEで増殖するのに十分な時間を提供するために48時間のインキュベーションを使用しました（図4C、図S10）。 私たちのアプローチには、空の DE のより高い割合を選別するというトレードオフと引き換えに、異なる種間の染色効率の偏りを制限するために、薄暗い蛍光 DE が含まれていました (図 4C)。 2 つの 96 ウェル プレート アレイ全体で、77 ウェルには選別された DE から回収された細菌が含まれており、そのうち 73 個 (95%) が 4 つの入力種すべてに対する選択プレーティングによって純粋培養物であることが確認されました (図 4D)。 GrowMiDE 濃縮からの 2 つの主要な種の存在量 (87% 大腸菌、12% プラスモディウム プチダ) と一致して、回収された純粋培養物の 79% が大腸菌、16% がプラスミド プチダでした。 これらの結果を総合すると、GrowMiDE + DE-FACS を使用した微生物の濃縮と分離の実現可能性が実証されています。

ここでは、定義されたコミュニティと未定義のコミュニティの両方で微生物を培養し、成長の遅い微生物のハイスループット濃縮を実行するための DE テクノロジーの新しいアプリケーションを実証しました。 私たちは、厳密な嫌気性菌を含む、代謝的に多様な多くの微生物種が GrowMiDE で増殖できることを実証しました (図 1)。 さらに、GrowMiDE は、増殖率戦略よりも増殖収量を追求する微生物の濃縮も促進します (図 3D)。 GrowMiDE 濃縮は、同じ濃縮培地を使用したバッチ培養では決して観察されなかった微生物種を独自に生成します (図 2、4)。 最後に、下流の特性評価と生理学的研究のための分離株を取得するためのプラットフォームとして GrowMiDE と DE-FACS を適用することを実証しました (図 4)。

私たちの研究では、栄養素の民営化により、成長の遅い種が競争から逃れることができました[1、2]。 DE は細胞と大きな高分子を別々のマイクロリアクター内で空間的に分離しますが、内部の水性コアは薄い油の殻によって環境から分離されているだけです。 したがって、油層で使用される局所的な界面活性剤やブロッキング剤に応じて、DE は酸素、塩、一部の染料などの小分子を選択的に透過する可能性があります [30、31、32、61]。 この効果は、界面活性剤の特性と濃度に応じて調整可能であると報告されています[61]。 DE における他のレオロジー研究では、ローダミン A、BSA 結合体、およびアンヒドロテトラサイクリンが、一部の DE 製剤の pH 媒介送達システムで油の殻を越えて移動できることも示されています [31]。 クロスオーバーの分子機構は不明ですが、促進拡散と自発的乳化が仮説されています[31、62]。

GrowMiDE 濃縮内で低レベルの炭素源クロスオーバーが発生した可能性がありますが、DE 内に保持されたグルコースのレベルは、成長の遅い L. lactis ΔldhA 変異体の増殖を促進するのに十分なレベルのままでした (図 3D)。 栄養素の民営化の程度は動的である可能性があります。 限られた競争が存在する部分的な民営化であっても、異なる集団を維持するには十分である可能性がある[63、64、65]。 別の可能性としては、特定の化合物に対する DE の低い透過性が M. smithii および/または P. faecium の増殖を促進した可能性があるということです。 P. faecium と M. smithii は、それぞれ腸内コミュニティからの交配代謝産物であるコハク酸塩と H2 に完全に依存していることが示されています。 ただし、どちらの化合物も GrowMiDE エンリッチメントには追加されませんでした。 H2 は発酵中に共濃縮された腸内種の多くによって生成され、HFE7500 オイル全体に容易に拡散するはずです。 DE 濃縮物のヘッドスペースでは H2 を検出できませんでしたが、特に M. smithii によって急速に消費された場合、H2 が検出限界未満 (<10ppm) であった可能性があります。 DE 濃縮物のサンプル量が少ないため (<500 µL)、CO2 を測定できませんでしたが、30 mM 重炭酸ナトリウムを添加した DE (mBHI+) または添加なし (mBHI) の DE インキュベーションにより、同様の M. smithii の濃縮が得られました。 P. faecium の濃縮については、混合コミュニティのサブセクションからのコハク酸クロスオーバーのピコモル濃度がどのようにして有意な濃縮を促進するのかは不明です。 既存の分離された 2 つの P. faecium 株の全ゲノム配列分析は、コハク酸からプロピオン酸への発酵がそれらの唯一の主要な異化作用であることを示唆しています [66]。 ただし、GrowMiDE 濃縮により、基礎 mBHI 培地または別の種によって生産された、当社の濃縮で利用可能な他の異化基質の使用が促進された可能性があります。 P. faecium はバクテロイデスとのビタミン B12 の共摂食に関与していることが示唆されている [67]。 DE 成分を補充した対照バッチ培養濃縮物では P. faecium が濃縮されず (データは示さず)、油または DE 界面活性剤の異化作用の可能性が排除されました。

私たちの腸内微生物叢の濃縮物では、成長の遅い種の相対的な存在量が大幅に増加したにもかかわらず、P. faecium をうまく分離できませんでした。 1 年にわたる複数の分離の試みでは、以前成功した P. faecium の分離をチョコレートまたは岐阜嫌気性培地プレートで再現できなかったことも含め、P. faecium 分離株を生成することはできませんでした [50、66]。 DE 内のコハク酸塩を含まない培地で生育する P. faecium の生理機能は不明であり、交差摂食の可能性があるため、分離されたコロニーを含む固体プレート上で同様の生育条件を再現することはできなかったのではないかと考えられます。 DE-FACS を使用して P. faecium を液体培養物に直接分離しようとしましたが、48 時間以上のインキュベーション後の SYTObc シグナルが低すぎて、嫌気条件下では空の液滴と完全な液滴を明確に区別できませんでした。 したがって、完全な嫌気条件下で機能する高蛍光色素が不足しているため、DE-FACS を適用して P. faecium を取得することは現在制限されています。 最近、嫌気性蛍光レポータータンパク質の作成に関する有望な研究が行われている[68、69]が、微生物生理学者は、遺伝的に扱いにくい系のための嫌気性蛍光色素の作成から大きな利益を得るであろう。 強力な蛍光色素の選択肢がないことに加えて、おそらく P. faecium を含む一部の厳密な嫌気性菌は、市販の FACS 装置での選別中に一時的な酸素曝露に耐えられない可能性があります。 しかし、FACS 機器にはカスタムの嫌気性選別チャンバーが存在し [70、71]、一部の厳密な嫌気性菌は選別後に正常に回収されています [72]。

培養種の数を拡大するためのマイクロ流体技術の最近の進歩には、単一細胞を分離してインキュベートするためのカスタムデバイス (iChip、SlipChip) [73、74、75] や、細菌コロニーがプレート上の培地条件全体に配列され、以下を使用して識別されるカルチュロミクスが含まれます。 MALDI-TOF [49]。 ただし、これらの技術はスループットが限られており、増殖した文化を分析して分類するには特殊で高価な機器が必要です。 GrowMiDE エンリッチメント プラットフォームは、多様なアプリケーションに非常に適しており、必要なのはシンプルな機器のみで、最小限のトレーニングですべてを組み立てて操作できます。 この研究では、GrowMiDE がより速く成長する微生物との競合を排除し、同じ培地条件下でのバッチ培養では明らかに失われる混合コミュニティからの微生物を濃縮することを示しました (図 4)。 ハイスループットのエンリッチメント ツールとして GrowMiDE を使用することに加えて、未定義の好気性コミュニティのスクリーニング ツールとして DE-FACS を使用するという将来の展望に興奮しています。 このような、急速に増殖する微生物に有利ではなく、一般に入手可能なFACS装置と互換性のある、このようなハイスループットの濃縮方法の開発は、「プレート数の大異常」と戦うための新しいアプローチとして機能する可能性があります。

リクエストに応じて、すべての生データと Matlab スクリプトを研究者が自由に利用できます。 16 S rRNA 遺伝子アンプリコン配列データは、BioProject PRJNA852267 の下で SRA に提出されました。

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L. lactis 株 NZ9000 および NZ9010 については H. Bachmann に、E. coli-GFP 株については A. Maheshwari に感謝します [76]。 また、実験について有益な議論をしてくれた Fordyce lab Dropception チームのメンバーと A. Bhatt 教授の研究室にも感謝します。 この研究は、深部ダークエネルギー生物圏調査センターを通じた米国国立科学財団、PMF に授与された NIH 1DP2 GM123641、およびシモンズ財団生命科学部門の AL McCully に対する海洋微生物生態学のシモンズ博士研究員フェローシップの一部によって支援されました。 、賞#600755。 PMF はチャン・ザッカーバーグのバイオハブ調査員です。

スタンフォード大学土木環境工学科、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

アレクサンドラ L. マッカリー & アルフレッド M. スポーマン

スタンフォード大学化学工学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

マッケンナ・ループ・ヤオ & アルフレッド・M・スポーマン

カリフォルニア大学バークレー校、化学・生体分子工学科、米国カリフォルニア州バークレー

マッケンナ・ループ・ヤオ

スタンフォード大学生物工学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

カラ・K・ブラウワー＆ポリー・M・フォーダイス

スタンフォード大学遺伝学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ポリー・M・フォーダイス

ChEM-H研究所、スタンフォード大学、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ポリー・M・フォーダイス

チャン・ザッカーバーグ・バイオハブ、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

ポリー・M・フォーダイス

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ALM、AMS、および PMF が設計した研究。 ALM と MLY は調査を実施しました。 KKB と PMF は新しい試薬/分析ツールを提供しました。 ALM、MLY、PMF、AMS の分析データ。 ALM、PMF、AMS が論文を執筆しました。

アルフレッド・M・スポーマンへの通信。

この研究で概説されている方法および技術は、共著者 KK B、SK、および PMF によって提出された米国特許出願、米国特許商標庁出願第 62/693800 号に開示されています。

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転載と許可

アラバマ州マッカリー、M. ループ・ヤオ、KK ブラウワー 他成長の遅い微生物のハイスループット濃縮および分離プラットフォームとしてのダブルエマルション。 イズムコミュ。 3、47 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s43705-023-00241-9

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受信日: 2022 年 11 月 22 日

改訂日: 2023 年 3 月 27 日

受理日: 2023 年 4 月 12 日

公開日: 2023 年 5 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00241-9

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