ヒトEAAT2のリガンド結合様式の構造基盤

Nature Communications volume 13、記事番号: 3329 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

中枢神経系（CNS）では、興奮性アミノ酸輸送体（EAAT）が興奮性神経伝達物質グルタミン酸の取り込みを媒介し、ニューロンの細胞毒性を回避するためにシナプス間隙におけるグルタミン酸の濃度を低く維持します。 EAAT の機能不全は、多くの精神疾患を引き起こす可能性があります。 今回我々は、基質グルタミン酸または選択的阻害剤WAY-213613の存在下で、内向き立体構造をとったヒトEAAT2のクライオEM構造を報告する。 グルタミン酸は広範な水素結合によって配位され、HP2 によってさらに安定化されます。 阻害剤 WAY-213613 は、基質グルタミン酸の結合ポケットと同様の結合ポケットを占めます。 WAY-213613 と会合すると、HP2 は実質的な構造変化を受け、次に疎水性相互作用を形成することによって阻害剤の結合を安定化します。 電気生理学的実験により、独特の S441 が hEAAT2 とグルタミン酸または WAY-213613 との結合において極めて重要な役割を果たし、I464-L467-V468 クラスターが WAY-213613 によるこのトランスポーターの選択的阻害の重要な構造決定因子として機能することが明らかになりました。

グルタミン酸は、哺乳類の中枢神経系の発達において重要な役割を果たし、学習、認知、記憶などの正常な脳機能に関与する主要な興奮性神経伝達物質です1。 また、過剰なグルタミン酸は興奮毒性を引き起こす可能性があり、グルタミン酸受容体の過剰な刺激によって神経細胞が死滅する可能性があります2。 したがって、細胞外液中のグルタミン酸濃度を低く維持することが重要です。 EAAT は、5 つのサブタイプ (EAAT1 ～ EAAT5) を含む興奮性アミノ酸輸送体として知られています。これらは、グルタミン酸を迅速に結合してシナプス前またはアストロサイトに戻すことにより、シナプス間隙からグルタミン酸を除去する役割を担っており、これが細胞終結に寄与します。シナプス活動の制御と、潜在的に細胞毒性のある細胞外グルタミン酸のクリアランスに影響を与えます3。 5 つの EAAT のうち、ヒト EAAT2 (hEAAT2) は主に星状膠細胞で発現され、エレベーター機構による前脳へのグルタミン酸取り込みの 90 ～ 95% に関与していると報告されています 3,4。 したがって、hEAAT2 は、ニューロンを保護する最も重要な EAAT の 1 つであるシナプス間隙の細胞外グルタミン酸を低レベルに維持できます 5,6。 hEAAT2 の欠損は、進行性のニューロン死、および大うつ病性障害、てんかん、アルツハイマー病、脳卒中、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの精神疾患または神経疾患を引き起こすため、hEAAT2 は潜在的な治療標的となります 6、7、8。

EAAT は構造的に古細菌の相同体である GltPh と類似しており、それらはすべて 3 つの同一のプロトマーから構成されるホモ三量体です 9,10。 個々のプロトマーは、8 つの膜貫通ヘリックス (TM 1 ～ 8) と 2 つのドメインに組織化された 2 つのヘアピン ループ (HP) を持っています。足場ドメインは TM1、2、4、および 5 で構成され、輸送ドメインの安定化を担当します。 トランスポート ドメインには、TM 3、6、7、および 8、HP1、および HP2 が含まれます。 これまでの研究では、EAATの個々のサブユニットが独立して基質を輸送できることが示されており11、12、13、基質結合部位はTM7（NMDGTモチーフ）、TM8の中央の巻き戻されていない領域、およびHP1およびHP23、9の先端によって構成されている。

古細菌ホモログ (GltPh4,9,10,14,15、GltTk16,17,18) と 4 つのヒト SLC1 トランスポーター (hEAAT119、hEAAT320、hASCT121、および hASCT222,23,24,25) の構造が解明されており、それらは共通しています。 TM7、TM8、HP1、HP2などのリガンド結合ポケットにおける高度な配列保存。 しかし、hEAAT2 はこれらのホモログと低い配列同一性を共有しているため (GltPh および GltTk との配列同一性 34%、hEAAT1 および hEAAT3 との配列同一性 50%、hASCT1 との配列同一性 42% および 39%) ため、hEAAT2 の構造を決定することが依然として望ましい。およびhASCT2、それぞれ）。 WAY-213613 は、hEAAT2 に対する強力かつ高度に選択的な阻害剤であり (IC50 は 85 nM)、hEAAT1 および hEAAT3 の親和性よりも 59 倍および 44 倍の親和性があります (IC50 はそれぞれ 5 μM および 3.8 μM)。 しかし、WAY-213613 が hEAAT2 によるグルタミン酸輸送を高度に選択的に阻害するメカニズムは依然として解明されていません。

ここでは、グルタミン酸および WAY-213613 と複合体を形成した三量体 hEAAT2 の 2 つの低温 EM 構造をそれぞれ報告します。 両方の構造は 3.4 Å の分解能で決定され、内向きの構造状態で安定化されます。 これらの構造は、hEAAT2 によって基質がどのように認識されるか、および WAY-213613 がどのようにトランスポーターを選択的に阻害するかの構造的基礎を解明します。 電気生理学的実験が実施され、私たちの推測が裏付けられました。

hEAAT2 は、興奮性アミノ酸輸送の仲介に加えて、陰イオン選択的チャネルとしても機能します 27、28、29。 hEAAT2 関連電流には、グルタミン酸誘導性アニオン電流、Na+ 依存性アニオンリーク電流、グルタミン酸輸送電流の 3 つの成分が含まれます 30,31。 競合阻害剤は、電流の 3 つの成分すべてをブロックできます 32。 グルタミン酸と阻害剤の結合部位についてさらに洞察を得るために、以前に記載されたものと同様の条件下で全細胞パッチクランプ技術を使用した電気生理学的実験を実施しました25。 以前の報告25、31、33と一致して、基質グルタミン酸の適用により、陰イオンリーク電流の振幅が増加しました（補足図1a）。 対照的に、WAY-213613 は陰イオンリークコンダクタンスをブロックすることができました (補足図 1b)。 グルタミン酸を介したアニオンリーク電流の活性化とWAY-213613によるアニオンリーク電流の阻害は両方とも用量依存性であり、ミカエリス・メンテン型の方程式に当てはめることができ、グルタミン酸のKmは30±2.5μM、見かけのKiは得られた。 WAY-213613 では 0.07 ± 0.03 μM (図 1a、b)、どちらも以前の報告と一致しています 26,34。

3μM、10μM、30μM、100μM、300μM、および1000μMグルタミン酸の存在下でのhEAAT2関連電流のグルタミン酸用量反応関係。 低濃度から高濃度までテストされるサンプル サイズ (n) は、5、5、5、5、5、および 8 セルです。 線は、グルタミン酸の平均見かけの Km が 30 ± 2.5 μM であるミカエリス・メンテンのような方程式への最良の適合を表しています。 電流は、1000 μM グルタミン酸の適用後に記録された最大電流に対して正規化されました。 b 0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、および30μMのWAY-213613の存在下でのhEAAT2関連電流のWAY-213613用量反応関係。 低濃度から高濃度までテストされるサンプル サイズ (n) は、5、5、5、5、5、5、および 10 セルです。 線は、WAY-213613 の平均見かけの Ki が 0.07 ± 0.03 μM であるミカエリス・メンテンのような方程式への最良の適合を表しています。 電流は、30 μM WAY-213613 の適用後に記録された最大電流に対して正規化されました。 図 a および b では、すべての実験は 0 mV で実行され、データは平均値 ± SD として示されています。 c 細胞質から見た hEAAT2 ホモ三量体の漫画表現。 実線はホモトリマーを 3 つの単一プロトマーに分割し、破線の曲線は各プロトマーの輸送ドメインを示します。 各プロトマーは、足場ドメイン (小麦) と輸送ドメイン (薄緑色) で構成されます。 構造要素 HP1 (青) と HP2 (赤) が強調表示されます。 特に指定のない限り、原稿全体で同じ配色が採用されています。 d 膜面から見た単一プロトマーの構造。 輸送ドメイン、HP1、HP2 は漫画として示され、足場ドメインは円柱として示されています。 図cおよびdでは、細胞膜の境界が灰色の線で表され、寸法情報が矢印の横にラベル付けされています。

hEAAT2の構造的特徴を解明するために、HEK293細胞で野生型hEAAT2を発現および精製しました（補足図1c）。 クライオEM研究は基質グルタミン酸および阻害剤WAY-213613の存在下で実施され、2つの3.4Åマップが生成されました（補足図2、3および補足表1）。 hEAAT2 は、他の EAAT (hEAAT119 および hEAAT320) およびそのオルソログ (hASCT121 および hASCT222,23,24,25) またはパラログ (GltPh4,9,10,14,15 および GltTk16,18) に似たホモ三量体構造を持っています。 hEAAT2三量体の各サブユニットには、8つの膜貫通ヘリックス（TM1〜TM8）と1対の半膜貫通スパイラルヘアピン（HP1、HP2）があります（図1c、d）。 これらの二次構造は、それぞれ足場ドメイン (TM1、2、4、5、および TM4b および TM4c に挿入された 2 つの細胞外ベータ シート) と輸送ドメイン (TM3、6 ～ 8 および HP1、HP2) に集合します。 2 つのドメインはそれぞれ、認識可能な内部二重対称性を示します。 個々のプロトマーの足場ドメインは、他の 2 つのプロトマーの足場ドメインと結合しており、ホモ三量体の中心部分でかなり安定した組み込みを構成しています。 そして、輸送ドメインは独自の足場ドメインによって分離され、正三角形のように分布しています（図1c）。 私たちのhEAAT2構造では、HP1は膜面とほぼ平行に位置し、ほとんどすべてが細胞質に露出しています（図1d）。 対応するHP2は脂質二重層に埋め込まれており、HP2チップは細胞質側から溶媒にアクセスできます（図1d）。 hEAAT2は、膜面の法線に沿って長さが約97Å、幅が約100Å、膜法線に沿って約70Åです（図1c、d）。

hEAAT2 の 2 つの分解構造の高解像度により、タンパク質の周囲に分布する多くのストリップ状の密度が観察されました (補足図 4a、b)。 最も豊富な脂質は、hEAAT2 三量体の 2 つの隣接するサブユニットの間に位置しており、これは hASCT2 (6RVX)23 または GltPh (6 × 15)14 の構造に見られる脂質の分布と類似しています。 hEAAT2 サンプルの調製中に、hASCT220 で報告された同様のシナリオとして、CHS が hEAAT2 の均一性と SEC プロファイルに重大な影響を与えることを発見しました。 実際、CHS に似た密度は、細胞膜の内側葉にある TM3、TM6、および TM8 によって形成された空洞に位置していることが判明しています（補足図 4c、d）。これは hEAAT335 および GltPh14 のマップでも見つかりました。 (それぞれ6S3Qおよび6×15)、コレステロールがSLC1トランスポーターおよびそのホモログの集合または機能と相関している可能性があることを示唆しています。

哺乳類の EAAT は、見かけのマイクロモルの親和性で l-グルタミン酸、l-アスパラギン酸、d-アスパラギン酸を輸送します3。 hEAAT2がどのようにグルタミン酸と結合するかを理解するために、グルタミン酸と複合体を形成したhEAAT2（hEAAT2Glu）の構造を3.4Åの分解能で決定しました（補足図2）。 hEAAT2Glu 構造では、グルタミン酸は HP1 および HP2 ループの先端によって封止されています (図 2a、b)。 足場ドメインを参照として使用して、外向きの hEAAT1Asp (PDB ID: 5LLU)19 と hEAAT2Glu 構造の間の構造比較を実行したところ、hEAAT2Glu 構造の輸送ドメインが膜を横切って細胞質側に約 17 Å 移動していることがわかりました。これは、hEAAT2Glu 構造が内向きの立体構造で決定されていることを示唆しています（補足図 5）。 輸送ドメインのこのような構造変化は、以前の観察とも一致しています24。 TM7 の巻き戻されていない領域 (NMDGT モチーフ 10) の高度に保存された極性残基の位置で、両親媒性 TM8 はグルタミン酸と広範な強力な相互作用 (主に水素結合相互作用) を形成し、グルタミン酸と hEAAT2 の結合を安定化します (図 2)。 2a)。 具体的には、基質であるグルタミン酸のα-カルボキシル基が、T479TM8およびN482TM8の側鎖、およびHP1の先端にあるS364HP1の主鎖Nと接触する。 基質グルタミン酸のアミノ基は、D475TM8 のカルボキシル基のみに配位します。 基質グルタミン酸のδ-カルボキシル基は、T401TM7およびR478TM8の側鎖と相互作用します（図2c、d）。 真核生物ホモログ（hEAAT119、hEAAT320、hASCT222）および原核生物ホモログ（GltPh14、GltTk17）と比較すると、基質結合に関与する重要な残基は、hEAAT2と上記のホモログの間で高度に保存されています（補足図6）。 ただし、hEAAT2のR478TM8は、中性アミノ酸トランスポーターhASCT2の対応する位置でC467TM8に置換されており（補足図6e）、これは中性アミノ酸に対するhASCT2の基質選択性に寄与しています20。 グルタミン酸結合部位を検証するために、D475TM8 と R478TM8 を別々にアラニンに変異させました (D475ATM8 と R478ATM8)。 電気生理学的実験では、野生型 hEAAT2 と比較して、グルタミン酸は最大 1 mM のグルタミン酸濃度でこれら 2 つの変異体の陰イオン電流を活性化できないことが示されました（図 2e および補足図 7a-c）。 いずれかの残基の変異がアニオンチャネルとしての hEAAT2 の活性を妨害する可能性を排除するために、これら 2 つの変異体のアニオン電流に対する WAY-213613 の阻害効果もテストしました。 その結果、WAY-213613の見かけのKiは30.48μM、D475ATM8では1.68μMに低下したが、WAY-213613によって誘導される見かけの外向き電流によって証明されるように、両方の変異体D475ATM8およびR478ATM8は依然として内向きアニオン電流を媒介することができた。それぞれ、R478ATM8とR478ATM8（図2fおよび補足図7e、f）。 したがって、残基 D475TM8 および R478TM8 は、hEAAT2 とグルタミン酸の結合に重要であり、このトランスポーターと WAY-213613 の結合にも関与している可能性があると我々は推測しています。

a 膜面から見た、グルタミン酸を含む hEAAT2Glu ホモ三量体 (色付きの球) の全体構造。 b hEAAT2Glu の単一プロトマーの分子表面をスライスし、グルタミン酸 (棒) とその EM 密度 (青色のメッシュ) を示します。 c グルタミン酸の詳細な結合部位 (黄色) とその主要な相互作用残基 (スティック)。 d LigPlot+によるグルタミン酸とその周囲の残基との相互作用を表す2Dプロット。 e 試験した変異体と野生型 hEAAT2 の間のグルタミン酸関連電流密度の比較。 電流は 1000 μM グルタミン酸で記録され、Na+ 依存リーク電流が差し引かれた後に表示されました。 野生型 hEAAT2、D475ATM8、または R478ATM8 についてテストされたサンプル サイズ (n) は 5、4、5 細胞です。 一元配置分散分析の後にボンフェローニの事後検定を行った (****P < 0.0001)。 f WAY-213613 D475ATM8、R478ATM8、または S441GHP2 媒介電流の用量反応関係。 WAY-213613 は以下の濃度で変化させました:D475ATM8 および R478ATM8 については 0.3 μM、1 μM、3 μM、10 μM、30 μM、および 100 μM。 S441GHP2 の場合は 0.03 μM、0.1 μM、0.3 μM、1 μM、3 μM、10 μM、および 30 μM。 電流は、30μMまたは100μMのWAY-213613の適用後に記録された最大電流に対して正規化した。 低濃度から高濃度までテストしたサンプル サイズ (n) は次のとおりです。D475ATM8 の場合は n = 4、5、5、5、5、および 9 セル。 R478ATM8 の場合、n = 5、5、5、4、5、および 12 セル。 S441GHP2 の場合、n = 4、4、4、5、5、4、および 7 セル。 線は、ミカエリス・メンテンのような方程式への最良の適合を表します。 図１ｂからの野生型ｈＥＡＡＴ２のデータを、試験した変異体のデータと比較した。 g hEAAT2Glu (薄緑色) と hEAAT3Apo (PDB ID: 6X3F、灰色) の間の輸送ドメインの構造比較。 h 0.1 μM、0.3 μM、1 μM、3 μM、10 μM、および30 μMのさまざまな濃度でのS441GHP2媒介電流のグルタミン酸用量反応関係。 線は、平均見かけの Km が 0.40 ± 0.03 μM であるミカエリス・メンテンのような方程式への最良の適合を表しています。 電流は、30 μM グルタミン酸の適用後に記録された最大電流に対して正規化されました。 低濃度から高濃度までテストされるサンプル サイズ (n) は、4、5、5、5、12、および 5 セルです。 図 e、f、h では、すべての実験は 0 mV で実行され、データは平均値 ± SD として示されています。

アポ状態（PDB ID: 6X3F）で内向きの hEAAT3 と比較して、hEAAT2Glu 複合体の HP2 はグルタミン酸が結合すると細胞内側に著しくシフトし（図 2g）、これにより基質の脱出が防止されることがわかりました。 この立体構造は、HP2 と周囲のヘリックスの間の水素結合によって安定化されます。 グルタミン酸結合に直接関与することに加えて、D475TM8はHP2からS444HP2の主鎖窒素と1つの水素結合を形成することもでき、これがHP2チップの拡大に寄与する（図2g）。 さらに、S441HP2の主鎖カルボニル基および側鎖は、それぞれS363HP1およびA394TM7の側鎖と相互作用します（図2g）。 まとめると、D475-S444、S363-S441、S441-A394 を含む 3 対の水素結合は、HP1 と HP2 を互いに近づけておくために重要です。 興味深いことに、S441HP2はhEAAT2にのみ存在し、各ホモログの対応する位置で保存されたグリシン残基に置換されています（補足図8）。 S441HP2 の機能的役割を調査するために、この残基をグリシン (S441GHP2) に置換し、さまざまな濃度のグルタミン酸の適用による電気生理学的記録を実行しました。 驚くべきことに、S441GHP2変異体はKmが0.40±0.03μMのグルタミン酸に対してより高い感受性を示すことがわかりました（図2hおよび補足図7d）。これは野生型hEAAT2の感度よりも〜77倍高く増加していますが、 S441HP2 はグルタミン酸結合に直接関与していません (図 2c、d)。 他のホモログの対応する位置に保存されたグリシンと比較して、この残基は hEAAT2 にのみ存在します（補足図 8）。 我々は、ユニークな残基 S441HP2 がおそらく追加の相互作用を提供して、HP2 を密封された構造で安定化し、細胞内側からのグルタミン酸の放出を防止すると推測しています。 したがって、S441HP2の変異はこれらの相互作用を破壊し、グルタミン酸の放出を促進し、グルタミン酸の取り込みサイクルを加速し、その結果、hEAAT2をより高い開放確率のチャネルに偏らせる可能性がある。 変異体S441GHP2に対するWAY-213613の見かけのKiは0.26μMに減少し(図2fおよび補足図7g)、これはこの部位が阻害剤の結合にも特定の方法で影響を与えることを示唆している。

WAY-213613 は hEAAT2 に対して高い選択性を示すため、hEAAT 間の特異性の違いを調査することが望ましい。 WAY-213613によるhEAAT2の阻害機構を調査するために、この阻害剤を使用したhEAAT2の複合体構造を3.4Åの解像度で決定しました（図3aおよび補足図3）。 WAY-213613 は、ブロモフルオロフェノール、アニリン、アスパラギン基を含む 3 つの官能基で構成されています (図 3b)。 この複雑な構造は、内向きの構造を採用しています。 膜の細胞質側に近いグルタミン酸結合部位で余分な密度が確認され、これは阻害剤WAY-213613とよく適合します（図3b）。 以下、本発明者らは、WAY-213613が結合したhEAAT2をhEAAT2W複合体と名付けた。 阻害剤WAY-213613の安定化に関与する相互作用は、阻害剤とその周囲の残基間の疎水性相互作用と水素結合で構成されます（図3c、d）。 より具体的には、WAY-213613のα-カルボキシル基は、S364HP1の主鎖窒素および側鎖ヒドロキシル基と接触を形成します。 WAY-213613のアミノ基は、D475TM8の側鎖カルボキシル基と配位しています（図3c）。 さらに、R478TM8はD475TM8と塩橋を形成するだけでなく、Y404TM7およびWAY-213613のアニリン基と2つのカチオン-π相互作用も形成します（図3c）。 これらの構造観察は、変異体D475ATM8およびR478ATM8が野生型hEAAT2と比較してWAY-213613との結合親和性の大幅に低下を示したという機能分析によっても裏付けられています（図2f）。 さらに、ブロモフルオロフェノール基は、疎水性残基I464TM8、L467TM8、V468TM8、M450HP2、およびL447HP2によって形成される疎水性空洞に包まれています（図3c）。 ブロモフルオロフェノール基は、Y404TM7とT字型配置でπ-πスタック相互作用を形成することによっても安定化されます（図3c）。 hEAAT2W 複合体の低温 EM マップでは、DDM 様分子が TM1 と TM8 の巻き戻されていないヘリックスの間に挟まれていることが判明しました。 その疎水性尾部は細胞外側を向いています。 頭部基はブロモフルオロフェノール基の近位に位置し、疎水性相互作用を形成してWAY-213613結合を安定化します（補足図4b、e）。 したがって、膜環境内の脂質分子が DDM の結合位置を占め、WAY-213613 によるグルタミン酸輸送の阻害効果に関与しているのではないかと考えられます。

a hEAAT2Wの膜面から見た全体構造。 WAY-213613 は球として表示されます。 b hEAAT2W の単一プロトマーの分子表面をスライスします。 WAY-213613 は棒で表示され、対応する EM 密度は青いメッシュで表示されます。 c hEAAT2WのWAY-213613の詳細な結合部位。 阻害剤 WAY-213613 (ピンク) と主要な相互作用残基は棒で示されています。 結合ポケットの疎水性残基は半透明の球として示されています。 d LigPlot+によるWAY-213613とその周囲の残基との相互作用を表す2Dプロット。 e hEAAT2W (薄緑色) と hEAAT2Glu (灰色) の間のグルタミン酸結合部位の構造変化。 hEAAT2W の HP2 は赤で強調表示され、黒の矢印は HP2 のシフトを示します。

また、hEAAT2GluとhEAAT2Wの構造を重ね合わせました（図3e）。 WAY-213613 の一部はアスパラギンに由来するため、阻害剤がグルタミン酸結合の状況と並行して同様の水素結合相互作用を形成することは驚くべきことではありません。 WAY-213613またはグルタミン酸のα-カルボキシル基およびα-アミノ基は、TM8およびHP1チップ（D475TM8およびS364HP1など）に由来する同じ残基クラスターによって配位されている（図2c、3c）。 しかし、WAY-213613が結合すると、阻害剤の疎水性ブロモフルオロフェノール基がM450HP2やL447HP2などのHP2の疎水性残基と相互作用し、その結果HP2をHP1チップから遠ざけ、HP2チップを開きます。 HP2bスパイラルは約22°の角度で外向きに回転し、HP2先端の距離は約8.0Åで変化します（図3e）。 HP2の移動のせいで、HP2先端の残基S441HP2およびS444HP2は、グルタミン酸結合hEAAT2構造に存在するHP1先端およびTM8とそれぞれ水素結合を形成することができません（図2g）。 代わりに、ヒドロキシ基S441HP2はT395TM7のカルボニル基と水素結合を形成し、したがってWAY-213613の結合状態を安定化しました（図3c）。これは、S441GHP2変異がWAY-213613に対するhEAAT2の感受性を低下させたという上記の機能分析と一致しています。 (図2f)。 WAY-213613の結合に関与する残基はHP1、HP2、およびTM8要素に由来するため、WAY-213613によって媒介されるこの相互作用ネットワークは、結果的にhEAAT2を内向きの立体構造状態に安定化させることができる。 さらに、WAY-213613によって安定化されたHP2のこのような開いた立体構造は、hEAAT2活性の重要なプロセスである立体構造変化を妨げる。

WAY-213613がどのようにhEAAT2を選択的にブロックするかを理解するために、内向きのhEAAT3Na（PDB ID：6X2L）20の構造をhEAAT2Wの構造と重ね合わせました（図4a〜c）。 我々は、WAY-213613のアスパラギン基がhEAAT3の構造とかなり互換性があることを発見した。 ただし、hEAAT3 ではブロモフルオロフェノール基に隣接するいくつかの残基が置換されています。 特に、hEAAT2のTM8の残基V468TM8、L467TM8、およびI464TM8は、hEAAT3ではそれぞれI437TM8、I436TM8、およびV433TM8に置換されます（図4cおよび補足図8）。 したがって、hEAAT3におけるこれらの置換は、hEAAT3におけるWAY-213613の結合ポケットの縮小をもたらし、これは、hEAAT3が阻害剤WAY-213613に対してhEAAT2と同じ高い親和性を示せない理由を示唆する（図4a、b）。 。 上記の仮説を検証するために、I464VTM8、L467ITM8、および V468ITM8 を含む 3 つの突然変異を設計しました。 電気生理学的実験は、突然変異がグルタミン酸結合に影響を及ぼさないことを示しています。 これらの3つの変異体では、外部溶液にグルタミン酸を適用すると、野生型hEAAT2と同様の効果で陰イオン電流を大幅に活性化できます（図4dおよび補足図9a〜c）。 ただし、これらの変異はWAY-213613に対する感受性の大幅な低下につながり、I464VTM8、L467ITM8、およびV468ITM8変異体のKiはそれぞれ〜0.17μM、〜0.46μM、および〜0.20μMに増加しました（図4eおよび補足図。 9d–f)、I464TM8、L464TM8、およびV468TM8残基がhEAAT2とWAY-213613の結合特異性にとって重要であるという我々の推測を裏付けています。

a hEAAT2W の WAY-213613 ポケットの表面表現 (薄緑色)。 WAY-213613はスティック(ピンク)で表示されます。 b WAY-213613 の hEAAT3Na (PDB ID: 6X2L) へのドッキング。 hEAAT3Na (青) の表面表現は、hEAAT3 の WAY-213613 結合ポケットの縮小を示します。 WAY-213613はスティック(ピンク)で表示されます。 c hEAAT2W (薄緑色) と hEAAT3Na (PDB ID: 6X2L、灰色) の輸送ドメインの構造比較。 WAY-213613 とその結合ポケット内の疎水性残基がスティックで表示されます。 hEAAT2W の HP2 は赤色で表示されます。 d I464VTM8、L467ITM8、またはV468ITM8媒介電流のグルタミン酸用量反応関係。 試験した変異体の用量反応関係を、図1aに示すグルタミン酸のさまざまな濃度で分析しました。 低濃度から高濃度までテストしたサンプル サイズ (n) を以下に示します。変異体 I464VTM8 の場合、n = 5、5、5、5、5、および 5 細胞。 変異体 L467ITM8 の場合、n = 4、4、5、5、5、および 5 細胞。 変異体 V468ITM8 の場合、n = 5、5、5、5、4、および 6 細胞。 e WAY-213613 I464VTM8、L467ITM8、または V468ITM8 媒介電流の用量反応関係。 WAY-213613としてのhEAAT2変異体の用量反応関係は、図1bに示された濃度で変化しました。 線は、それぞれ、見かけの Ki が 0.166 μM、0.464 μM、および 0.196 μM であるミカエリス・メンテンのような方程式への最良の適合を表しています。 電流は、30 μM WAY-213613 の適用後に記録された最大電流に対して正規化されました。 低濃度から高濃度までテストされたサンプル サイズ (n) は次のとおりです。I464VTM8 の場合、n = 5、5、5、4、4、5、および 10 セル。 L467ITM8 の場合、n = 5、5、5、5、5、4、および 11 セル。 V468ITM8 の場合、n = 5、5、5、5、5、5、および 11 セル。 図１ｂからの野生型ｈＥＡＡＴ２のデータを、試験した変異体のデータと比較した。 イチジクで。 d および e、すべての実験は 0 mV で実行され、データは平均値 ± SD として表示されました。

これまでのところ、hEAAT2 ホモログの一連の構造は、競合阻害剤 TBOA10、14、18、TFB-TBOA14、19、35、p-OMe-アゾのトランス異性体およびシス異性体を含む、さまざまな種類の阻害剤の存在下で決定されています。 -TBOA36、Lc-BPE25、およびアロステリック阻害剤 UCPH-10119。 hEAAT2Wとさらに比較するために、GltPhTFB-TBOA（PDB ID：6×14）14、GltPhTBOA（PDB ID：6×16）14、およびhEAAT3TFB-TBOAを含む、内向きの立体構造を有する複雑な構造が採用されました（補足図10a）。 (PDB ID:6S3Q)35． GltPhTBOAおよびhEAAT3TFB-TBOAの構造では、阻害剤はHP2の2つのヘリックスに挿入してHP2aをHP2bから分離し、したがってトランスポーターの構造変化をブロックします（補足図10b、c）。 ただし、hEAAT2W複合体におけるWAY-213613の配向は、GltPhTBOAおよびhEAAT3TFB-TBOA複合体の阻害剤の配向とは大きく異なります（補足図10a-c）。 WAY-213613のブロモフルオロフェノール基は、TM8、TM7b、およびHP2bによって形成される「深い疎水性空洞」に位置しています（図3cおよび補足図10a）。 GltPhTFB-TBOA複合体は、hEAAT3TFB-TBOA複合体の結合部位とは異なる結合部位を示します（補足図10c、d）。 対照的に、GltPhTFB-TBOA複合体は、hEAAT2W複合体の結合部位と同様の結合部位を示すようです（補足図10a、d）。 ただし、TFB-TBOAは、hEAAT2のWAY-213613の「深い空洞」に近づくことができません（補足図10e）。上記の結果は、WAY-213613が以前は未確認の空洞に結合していることを明らかにしています。

hEAAT2 はアストロ サイトで最も豊富に発現される興奮性アミノ酸輸送体であり、ニューロンの細胞毒性を防ぐためにシナプス間隙からアストロ サイトへのグルタミン酸の取り込みに必須です 3。 今回我々は、グルタミン酸と複合体を形成した hEAAT2Glu のクライオ EM 構造を報告します。これにより、hEAAT2 がどのようにグルタミン酸を認識するかの分子詳細が明らかになります。 真核生物ホモログ（hEAAT119、hEAAT320、hASCT222）および原核生物ホモログ（GltPh14、GltTk17）（補足図6）と比較すると、基質結合に関与する重要な相互作用残基は、hEAAT2と上記のホモログの間で高度に保存されています。 一方、我々は、独特の残基S441HP2がhEAAT2にのみ存在し、他のホモログの対応する位置で保存されたグリシンに置換されていることを発見した（補足図8）。 電気生理学的実験により、グルタミン酸に対するS441GHP2の親和性が野生型hEAAT2の親和性と比較して大幅に増加する可能性があることが示されました（図2h）。 特に、S441HP2はHP2先端に位置しており、グルタミン酸との相互作用に直接関与していません（図2g）。 したがって、我々は、S441HP2 がグルタミン酸の輸送速度に影響を与える可能性があると推測しています。 hEAAT2におけるS441HP2の機能的役割を明らかにするには、さらなる実験が必要である。

この研究では、阻害剤WAY-213613と複合体を形成したhEAAT2の構造も解明し、これにより、WAY-213613に対するhEAAT2の結合ポケットが明確に解明された。 hEAAT2W複合体は、内向きの立体構造状態で安定化されます。 WAY-213613 のα-カルボキシル基、α-アミノ基、およびアニリン基は、残基 S364HP1、D475TM8、および R478TM8 と接触し、基質グルタミン酸と重複結合部位を共有します。これは、WAY-213613 が競合阻害剤であるという考えと一致しています。 。 hEAAT2W複合体では、HP2が顕著な構造変化を起こし、回転してHP1から離れるため、WAY-213613結合に十分なスペースが生じます。 興味深いことに、S441HP2はT395TM7と水素結合を形成し、その結果HP2を開いた立体構造に安定化させることが判明し、この相互作用がWAY-213613結合にとって重要であることが判明した（図3c、2f）。 一方、WAY-213613のブロモフルオロフェノール基は、I464TM8、L467TM8、V468TM8、M450HP2、L447HP2など、TM8、TM7b、HP2bのいくつかの疎水性残基によって包まれています（図3c）。 構造比較と配列アラインメントに基づいて、hEAAT2のTM8の残基I464TM8、L467TM8、およびV468TM8は、他のhEAATの対応する残基と比較して変化しています（図4c）。 電気生理学的実験は、上記の3つの残基が高い効力でWAY-213613によるhEAAT2の阻害に重要であり、3つの残基のそれぞれにおける変異により、WAY-213613によるhEAAT2の阻害効率が実質的に低下することを実証する（図4e）。 hEAAT2 の I464-L467-V468 クラスターが、hEAAT3 では Val-Leu-Ile、hEAAT1/hEAAT4/hEAAT5 では Ile-Ile-Val にそれぞれ置換されていることを考慮すると、TM8 の I464-L467-V468 クラスターは、 WAY-213613 による hEAAT2 の選択的阻害の重要な構造決定因子。

全長 hEAAT2 (UniProtKB アクセッション: P43004) 遺伝子を HEK293 cDNA からクローン化し、N 末端 Strep∙ Tag II に続いてスーパーフォルダー GFP (sfGFP) および PreScission Protease を有する修飾 pEG BacMam ベクターに構築しました ( PPase) 認識サイト。 Bac-to-Bac バキュロウイルス発現システム (Invitrogen) を使用して、HEK293F 細胞で hEAAT2 組換えタンパク質を発現させました。 簡単に説明すると、製造業者（Bac-to-Bac; Invitrogen）の指示に従って、プラスミドpEG-strep-GFP-hEAAT2を大腸菌DH10bac細胞に形質転換し、hEAAT2遺伝子を含むバクミドプラスミドを取得した。 次に、バキュロウイルスを Sf9 細胞 (Spodoptera fragiperda-9 細胞) で取得し、72 時間の増幅後に P2 ウイルスを収集しました。 HEK 293F 細胞を 37 °C で 2.5 × 106 細胞/ml の密度まで培養し、P2 ウイルスを 1% (v/v) の比率で添加してトランスフェクションを開始し、同時に 1 mM グルタミン酸 (Sigma- Aldrich) または 5 μM WAY-213613 (MedChemExpress)、および 1% (v/v) FBS (ウシ胎児血清) を加え、シェーカー内で 37 °C、5% CO2 でインキュベートしました。 8 ～ 12 時間の培養後、10 mM 酪酸ナトリウムを添加し、細胞を 48 時間インキュベートし続けた後、2500 × g、4 °C で 5 分間遠心分離して細胞を回収しました。

細胞ペレットを、1:1000希釈の哺乳類プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma- Aldrich）または液体窒素で急速冷凍し、さらに使用するために -80 °C で保存します。 再懸濁した細胞をダウンスホモジナイザーで破壊した。 10,000 × g、4 °C で 10 分間の遠心分離によって細胞破片を除去し、上清を 4 °C、100,000 × g で 0.5 時間超遠心分離しました。 粗膜ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した緩衝液Aに再懸濁し、均質化した。 1% (w/v) n-ドデシル-β-d-マルトピラノシド (DDM; Anatrace) および 0.2% (w/v) ヘミスハク酸コレステリル (CHS; Sigma-Aldrich) を均一溶液に添加し、その後 2 時間可溶化しました。 4℃で穏やかに撹拌しながら。 100,000 × g、4 °C で 0.5 時間超遠心分離した後、不溶性の破片を除去し、可溶化した物質を 0.22 μM フィルター (Merck Millipore) で濾過しました。 続いて、濾液を、緩衝液B(0.025% (w/v) DDMおよび0.005% (w/v) CHSを補充した緩衝液A)で予め平衡化したストレプタクチンビーズ(Smart-Lifesciences)カラムに、 ～0.2ml/分。 カラムを10カラム容量(CV)の緩衝液Bで洗浄して未結合物質を除去し、タンパク質を4カラム容量の緩衝液C(5mM d-デスチオビオチンを補充した緩衝液B)で溶出した。 N 末端 Strep・Tag II および GFP を、適切な比率の自家製 PreScission プロテアーゼと 4 °C で 3 時間インキュベートすることにより消化しました。 hEAAT2 サンプルを 100 kDa カットオフ濃縮器 (Merck Millipore) を使用して 1 ml に濃縮し、緩衝液 B であらかじめ平衡化した Superose 6 Increase 10/300 GL (GE Healthcare) を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製しました。精製タンパク質を含むタンパク質を収集し、クライオ EM グリッド調製のために直ちに濃縮しました。

クライオ EM イメージング用のグリッドを準備するために、新たに精製したタンパク質を濃縮し、氷上で 2 mM グルタミン酸または 200 μM WAY-213613 を補充し、30 分間インキュベートしました。 全体として、12.6 mg/ml hEAAT2Glu 複合体または 10 mg/ml hEAAT2W 複合体 2.5 μl をホーリーカーボンクライオ EM グリッド (Quantifoil Cu R1.2/1.3、300 メッシュ) に適用し、60 秒間グロー放電させました。 Solarus プラズマクリーナー (Gatan) により H2O2 状態にします。 グリッドは、Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) 内で 4 °C、湿度 100% で 2.5 秒間ブロットされ、その後液体エタンに浸漬して凍結させてガラス化し、液体窒素で保存しました。 Cryo-EM データは、GIF 量子エネルギーフィルターの後に配置された Gatan K2 Summit 直接電子検出器 (Gatan) を備えた 300 kV Titan Krios 透過型電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific) を使用して取得しました。 エネルギーフィルターのスリットを 20 eV に設定し、公称デフォーカス範囲 1.5 ～ 2.5 μm で倍率 130,000 倍 (ピクセル サイズ 1.04 Å) の超解像度計数モードでムービースタックのロボット収集に SerialEM37 を使用しました。 ムービースタックの総線量は約 50 e/Å2 で、線量率範囲は 8.5 ～ 9.0 e-/Å2/s で 60 フレームにわたって分布しました。

hEAAT2Glu 複合体のデータセットについては、合計 2256 の用量分割ムービーが収集され、MotionCor238 を使用してビーム誘発運動が補正され、GCTF39 によってコントラスト伝達関数 (CTF) の推定が決定されました。 CTF 推定が不十分であるか、氷による汚染を示す 148 枚の画像が破棄され、特に言及しない限り RELION-3.140 による後続の分析用に選択された 2108 枚の画像が得られました。 Gautomatch を使用して合計 1,509,287 個の粒子が自動的に選択され、cryoSPARC41 の Ab-initio Reconstruction を使用して初期参照が計算されました。 ガイド付きマルチリファレンス 3D 分類の 2 ラウンドが、バイアスされたいくつかのマップに対して実行され、C3 対称性が課せられた良好なリファレンスが得られました。 結果として得られた 3D 分類の最初のラウンドでのクラス 4 (41.8%) と 3D 分類の 2 回目のラウンドでのクラス 4 (82.8%) は、明確に分解された膜貫通ヘリックスを示し、次の 3D 精密化に提出され、3.9 Å が得られました。解像度マップ。 hEAAT2 マップの品質をさらに向上させるために、タイト マスクと適用された C3 対称性を使用して、アライメントなしの 3D 分類が実行されました。 6 つのクラスのうち最良の 1 つのクラス (15.0%) を構成する粒子が、C3 対称性とタイト マスクによる後処理を使用したさらなる CTF リファインメントと 3D 自動リファインメントのために選択され、報告された GSFSC 基準 42 に従って最終マップを 3.4 Å の解像度に改善しました。

hEAAT2W 複合体のデータセットについては、合計 465 の線量分割ムービーが収集され、MotionCor238 を使用してビーム誘発運動が補正され、GCTF39 によって CTF 推定値が決定されました。 cryoSPARC41 のテンプレート ピッカーを使用して、420 ​​枚の顕微鏡写真から合計 233,008 個の粒子が選択されました。 抽出された粒子は 2 回の 2D 分類にかけられました。 良好な 2D クラス平均が選択され、C3 対称性が課された 3D 異種リファインメントが適用されました。 結果として得られた 98,685 個の粒子を含む良好な 3D クラスに 3D 不均一リファインメントを適用して、解像度 3.7 Å のマップを生成しました。 98,685 個の粒子が RELION-3.140 で再抽出され、その後 3D 自動精製、後処理、研磨が行われて粒子品質がさらに向上し、研磨された粒子が creoSPARC に再インポートされました。 C3 対称性を課した 3D 不均一リファインメントの後、最高クラスの 98,536 個の粒子が不均一リファインメントを受けました。 最終的に、解像度 3.4 Å のマップが得られました。

hEAAT2Glu 複合体のモデル構築では、非タンパク質成分を除去した以前にリリースされた hEAAT3 のクライオ EM 構造 (PDB ID: 6S3Q)35 を参照モデルとして使用し、Chimera43 を使用して密度マップにドッキングし、続いて COOT44 で手動で調整しました。 この高解像度マップは、タンパク質配列を視覚的に割り当て、大部分の残基 (37 ～ 148、162 ～ 195、および 229 ～ 507) を自信を持ってモデル化できます。 HP2 および HP1 の上部で覆われた空間中心の各プロトマーで孤立した固体密度が見つかりました。これは、グリッドが調製され、類似の基質アスパラギン酸またはグルタミンが同様の部位に結合したときに、あらかじめ存在していた 2 mM グルタミン酸の密度であると考えられました。 hEAT2 ホモログで。 グルタミン酸分子は、COOT を使用して手動で密度にドッキングされました。 PC1 (1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン) および CHS の制限は、Phenix の eLBOW45 によって導出されました。 ここでは、PC1 をモデル脂質として使用し、対応する密度に適合させるためにアシル鎖またはエタノールアミンヘッドを除去しました。 その後、モデルは COOT で手動調整され、Phenix を使用してデフォルト パラメーターを使用した実空間改良 46 を繰り返してマップに対して改良されました。 検証には MolProbity47 を使用しました。 hEAAT2 の最終モデルは良好な形状を獲得しました (補足表 1)。 フーリエシェル相関（FSC）曲線は、最終的な精製されたマスクされていないモデルとマスクされたマップの間で計算され、また、精製されたモデルとhEAAT2のマップの相互検証も計算されました（補足図2および補足表1）。 図は、UCSF ChimeraX48 および PyMOL49 または LigPlot+50 を使用して作成されました。

ヒト胎児腎臓 293T (HEK293T) 細胞を、15% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS、PAN-Biotech) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、Gibco) 培地で 37 °C、5% CO2 で培養しました。 HEK293T 細胞を培養皿 (d = 3.5 cm) (Thermo Fisher Scientific) で 24 時間増殖させた後、皿あたり 1 μg の hEAAT2 野生型および変異体プラスミドを使用して、0.7 μg のリポフェクタミン 2000 試薬 (Thermo) を使用して HEK293T を一時的にトランスフェクトしました。フィッシャー・サイエンティフィック)。 トランスフェクション後 24 ～ 40 時間、室温 (21 ～ 25 °C) で電気生理学的実験を使用して細胞を分析しました。

電気生理学的実験は、以前に記載されているように若干の変更を加えて実行されました25。 外部バッファーには 140 mM NaCl、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、および 10 mM HEPES (NaOH で pH = 7.4、浸透圧約 310 mosmol L-1) が含まれ、内部ピペット溶液は 130 mM NaSCN、2 mM MgCl2、 10 mM EGTA、10 mM HEPES (NaOH で pH = 7.4、浸透圧約 310 mosmol L-1)、および 10 mM グルタミン酸。 50 mM WAY-213613 ストック溶液をジメチルスルホキシド (DMSO) で調製し、続いて上記の外部緩衝液で使用濃度に希釈しました。 私たちの実験では最大 0.5% DMSO が使用されましたが、対照細胞の電気生理学的結果には影響しませんでした。 全細胞パッチクランプ実験の記録は、単離された GFP 陽性 HEK293T 細胞 (hEAAT2 野生型および変異体) から作成されました。 全体として、研磨されたピペット (Sutter Instrument) の点火には 3 ～ 6 MΩ が使用されました。 比較的小さい電流と補償は観察される電流の大きさに影響を及ぼさなかったため、これらの実験では直列抵抗は補償されませんでした。 細胞を、特定の濃度のグルタミン酸またはWAY-213613を添加した上記の外部緩衝液に浸漬した。 グルタミン酸誘導性アニオン電流、Na+依存性アニオンリーク電流およびグルタミン酸輸送電流、またはWAY-213613阻害アニオンリーク電流は、EPC-10アンプ(HEKA Electronic)を使用し、サンプルレート20kHz、ローパスフィルター5kHzで記録しました。 すべての実験は 0 mV で実行されました。 細胞電流が安定した後、グルタミン酸または WAY-213613 は、外部投与により指定された濃度で少なくとも 6 秒間維持されました。 続いて、新たなラウンドの適用を開始するか実験を終了するために、細胞を外部緩衝液で洗い流した。 プラトー電流は次の計算に使用されました。 分析のために、記録後 5 秒でデータを PatchMaster プログラム (HEKA Electronic) によって取得しました。 非線形の用量反応関係を以下に示すミカエリス・メンテンのような方程式に当てはめて、グルタミン酸または WAY-213613 の存在下で見かけの Km および Ki 値を取得しました。

この式では、I はさまざまなグルタミン酸または阻害剤濃度での電流を表し、Imax はグルタミン酸または阻害剤の飽和濃度での最大電流を表します。 [C]はグルタミン酸または阻害剤の濃度を表します。 Km/iは見かけの定数を表します。

統計的有意性は、一元配置分散分析と、それに続く図の凡例に詳細に記載されているボンフェローニの事後検定を使用して評価されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

hEAAT2Glu および hEAAT2W の三次元クライオ EM 密度マップは、それぞれアクセッション コード EMD-33407 および EMD-33408 で EM データベースに寄託されており、構造の座標はアクセッション コードでタンパク質データ バンクに寄託されています。コードはそれぞれ 7XR4 と 7XR6 です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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中国科学院生物物理研究所（IBP、CAS）のタンパク質科学の中核施設である生物イメージングセンター（CBI）のB. Zhu氏と他のスタッフのクライオEMデータ収集への支援に感謝します。 Bei Yang氏とYan Wu氏のリサーチアシスタントサービスに感謝します。 この研究は、中国国家脳科学および脳様知能技術プログラム (YZ への助成金番号 2022ZD0205800)、中国科学院の戦略的優先研究プログラム (YZ への助成金番号 XDB37030304)、国家重点研究開発プログラムによって資金提供されています。中国 (YZ への助成金番号 2021YFA1301501)、中国国立自然科学財団 (YZ への助成金番号 92157102 および JJ への助成金番号 32070031、31770051)、中国科学院生物物理研究所、国立生体高分子研究所 (助成金番号 2021kf10 および 2022kf09)、中国国家脳科学および脳様知能技術プログラム (ZH への助成金番号 2021ZD0202102)、および中国国家自然科学財団 (ZH への助成金番号 81371432)。

Zhenglai Zhang、Huiwen Chen、Ze Geng の著者も同様に貢献しました。

東北農業大学生命科学部微生物学およびバイオテクノロジー学科、No. 600 Changjiang Road, Xiangfang District, Harbin, 150030, China

チャン・ジェンライ、チェン・フイウェン、ジャン・ジュクアン

生体高分子国立研究所、CAS 生体高分子エクセレンスセンター、中国科学院生物物理研究所、北京、100101、中国

Zhenlai Zhang、Huiwen Chen、Zhuoya Yu、Hang Li、Yanli Dong、Hongwei Zhang、Yan Zhao

北京大学健康科学センター、薬学部分子細胞薬理学部門、天然および生体模倣薬の国家重点研究所、北京、100191、中国

ゼ・ゲン＆ジュオ・ファン

IDG/マクガバン脳研究所、北京大学、北京、100871、中国

ゼ・ゲン＆ジュオ・ファン

中国科学院生物物理研究所、脳・認知科学国家重点研究所、15 Datun Road、Beijing、100101、中国

卓雅裕 & 燕昭

中国科学院大学生命科学部、北京、100049、中国

Zhuoya Yu、Hang Li、Hongwei Zhang、Yan Zhao

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YZ はこのプロジェクトを発案し、研究を監督しました。 ZZ はクライオ EM 研究用にサンプルを準備しました。 HC と ZY はクライオ EM データを収集し、EM マップを計算しました。 ZZ と ZY は原子モデルを構築し、改良しました。 HL、YD、HZ はタンパク質サンプルの精製に役立ちます。 YZ、JJ、ZZ が構造を解析しました。 ZH と YZ が設計し、ZG が電気生理学的実験を実施しました。 ZZ、HC、ZY が原稿の最初の草稿に貢献しました。 YZ と JJ は、最終版の著者全員からの意見をもとに原稿を編集しました。

Zhuo Huang、Juquan Jiang、Yan Zhao に相当します。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Rosemary Cater 氏、Josep Font Sadurni 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Zhang、Z.、Chen、H.、Geng、Z. 他。 ヒトEAAT2のリガンド結合様式の構造基盤。 Nat Commun 13、3329 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-31031-x

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受信日: 2021 年 11 月 8 日

受理日: 2022 年 5 月 31 日

公開日: 2022 年 6 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31031-x

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