抗生物質治療はバイオフィルムを悪化させる可能性がある

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 26 (2023) この記事を引用

889 アクセス

13 オルトメトリック

メトリクスの詳細

クオラム・チーティングは、細胞密度感知（クオラムセンシング）システムの突然変異に基づく社会微生物学的プロセスであり、主要なヒト病原体である黄色ブドウ球菌のバイオフィルム関連感染の重要な原因として浮上しています。これは、ブドウ球菌の Agr 菌数感知システムの不活化により顕著なバイオフィルムの形成が引き起こされ、抗生物質に対する耐性と免疫防御機構が増加するためです。クリニックにおけるバイオフィルム感染は、通常、抗生物質治療下で進行するため、ここでは、そのような治療がクオラム不正行為の促進を介してバイオフィルム感染を促進するかどうかを調査しました。クオラムチーターの発生は、ブドウ球菌バイオフィルム感染の治療に使用されるいくつかの抗生物質によって、浮遊増殖様式よりもバイオフィルム内でより強く刺激されました。レボフロキサシンおよびバンコマイシンの準阻害濃度が、バイオフィルム関連（皮下カテーテル関連感染および人工関節関連感染）に及ぼす影響について調査されました。バイオフィルム関連ではない皮下皮膚感染モデルとは対照的に、細菌負荷と agr 変異体の発生が観察されました。我々の結果は、動物バイオフィルム関連感染モデルにおけるAgr機能不全の発生を直接示しており、不適切な抗生物質治療は、クオラム不正行為とそれに関連するバイオフィルムの発達を促進するため、そのような感染症に対して逆効果となる可能性があることを明らかにしています。

医療関連（院内）感染症（HAI）は、高所得国では入院患者の平均 7.6% に影響を与えています1。米国では、HAI による死亡率は年間約 99,000 人と推定されており 2、最近若干減少したにもかかわらず依然として相当数です 3。低所得国では、HAI の発生率と死亡率はさらに高くなります1,4。 HAI の多くは、外科用インプラント、補綴装置、尿路、静脈内、または中心線関連カテーテルなどの留置医療装置の感染に起因します5。デバイス関連の感染によって致命的な結果となることが多いのは、そのほとんどが、感染したデバイスから発生する血流感染によるものです6、7。たとえば、中心線関連血流感染症（CLABSI）は、HAI の中で最も致死性の高いタイプの 1 つであり、死亡率は 12 ～ 25% です8。デバイスに関連した感染症は、バイオフィルムの形成により治療が難しいことで知られています。バイオフィルムは細菌の凝集体であり、デバイスの内外表面を覆い、抗生物質に対して顕著な耐性を示します9、10、11、12。そのため、機器に関連した感染症は、現代の医薬品開発戦略によっても治療が特に困難なままです13。

デバイス関連感染症の最も一般的な原因の 1 つは黄色ブドウ球菌です 14。密接に関連するコアグラーゼ陰性ブドウ球菌など、これらの感染症でよく見られる他の細菌と比較して、黄色ブドウ球菌による機器関連感染症は、黄色ブドウ球菌の毒性がより顕著であるため、通常、より重篤な臨床進行と転帰を示します14,15。 16. 黄色ブドウ球菌は、抗生物質治療に対する例外的な抵抗力で悪名高く17、これは部分的には、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）のmecAなどの特定の抗生物質耐性遺伝子によるものです17,18。しかし、バンコマイシンなど、通常は MRSA を効果的に殺す抗生物質でさえ、バイオフィルム中の MRSA に対する活性は大きく低下しており 19,20、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌 (MSSA) によって形成されたバイオフィルムも抗生物質治療に対して顕著な耐性を示しています 21,22。したがって、バイオフィルム感染における抗生物質耐性のメカニズムを理解することは、この主要な院内病原体の治療戦略を改善するために不可欠です。

過去数十年にわたり、バイオフィルム形成の分子基盤について集中的な研究が行われてきました。これにより、黄色ブドウ球菌および他のバイオフィルム形成病原体において、構造的、代謝的、または調節的能力においてバイオフィルム形成に関与する多種多様な分子の同定がもたらされた 23,24。たとえば、細胞密度の増加によってもたらされる変化する条件に細菌の生理機能を適応させるクオラムセンシング (QS) システムは、多くの細菌におけるバイオフィルムの発達において重要な役割を果たしています 25,26。黄色ブドウ球菌には、アクセサリー遺伝子調節因子の略で Agr と呼ばれる 1 つの QS システムが存在します 27,28。 Agr は、バイオフィルムの発達に寄与するいくつかの因子を制御します。その中には、バイオフィルムマトリックスを分解するプロテアーゼとヌクレアーゼ、およびマトリックス高分子間の非共有結合相互作用を妨げることによってバイオフィルムを構造化する両親媒性ペプチドであるフェノール可溶性モジュリン（PSM）などがあります 23,29,30。 PSM が存在しないと、バイオフィルムチャネルの形成が減少し、agr 変異体で見られるのと同様に顕著な程度で全体的により厚くより緻密なバイオフィルムが形成され、バイオフィルムの発達における PSM の重要な役割が示されています 31。また、バイオフィルム関連感染症のモデルにおける黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌における Agr および PSM の役割も確認しました 25、31、32、33、34。ただし、これらは、in vitro 所見の妥当性を確認するためにバイオフィルム感染モデルが使用されたかなり稀な例です 25。一般に、バイオフィルム感染の動態は依然として不完全に理解されています。

我々は以前、Agr 機能不全の黄色ブドウ球菌変異体が in vitro でかなりの程度まで発生することを報告した 32。黄色ブドウ球菌 Agr 機能不全変異体のような QS 機能不全変異体の発生は一般に「クォーラム不正行為」と呼ばれ、緑膿菌の QS システムで最初に観察されました 35。クオラム・不正行為とは、集団内の一部の細菌が、不正行為者と不正行為者以外の均衡が保たれるまで、集団の他のメンバーに依存して、栄養素の獲得に必要な、コストのかかる QS 制御による分解酵素の分泌を遮断するという社会微生物学的現象を指します。発展する36。

主に in vitro 研究を使用して確立されていますが、クォーラム不正行為とクォーラム不正行為制御の同様の原則が in vivo 感染にも適用されるという証拠があります 37,38。重要なことに、我々や他の研究者らは、Agr機能不全変異体が黄色ブドウ球菌感染分離株、特に感染した留置装置上のバイオフィルムに由来することが多いバイオフィルム関連感染や血液感染から分離された株で頻繁に見つかる可能性があることを報告している39,40,41。 42、43。私たちの研究室での最近の動物研究では、バイオフィルム関連感染症における agr 変異体の発生は、特定の in vivo 環境に強く依存しており、agr 変異体のバイオフィルム形成が増加するため、社会微生物学的モデルの予測に完全には従わないことが示されています32。自然免疫メカニズムに対する抵抗力の増加を仲介します。バイオフィルム環境における免疫回避に対する Agr 機能不全のこの明らかに重要な重要性に従って、我々は最近、連続分離株の分析を用いて、Agr 機能不全変異体がヒトの臨床 PJI40 中に発症することも発見しており、この観察はその後嚢胞性線維症でも同様の形で観察された 44 。注目すべきことに、私たちの以前の研究では、臨床バイオフィルムは、社会微生物学的モデルが予測したようなAgr機能細菌と機能不全細菌の平衡ではなく、事実上100％agr変異体（「クオラムチーター」）で構成されていました32。この最近の臨床研究では、患者が一般に抗生物質療法を受けていたという事実から、本研究では、バイオフィルム感染の動物モデルを使用して、抗生物質療法が、可能性のある刺激を介して抗生物質耐性バイオフィルムの発生に役割を果たしているかどうかを調査するようになりました。クォーラム不正行為の影響。

我々は最初に、Agr機能不全の代用として溶血能力を決定する一般的なアプローチを使用して、in vitroで阻害未満濃度の抗生物質で治療中のAgr機能不全変異体の発生を分析しました32、39、41、45（図1a）。浮遊性の MIC 濃度には 1/4 の MIC 濃度を使用し、バイオフィルムの増殖モードには 5 (浮遊性) MIC 濃度を使用しました 40。これらの濃度は、実験設定の条件下で同様に適度な増殖阻害を引き起こすため選択されました（補足図1）。バンコマイシン (Van)、レボフロキサシン (Lev)、およびクリンダマイシン (Cli) がこの実験の抗生物質として選択されました。これらは当院の PJI に最も頻繁に使用され、Agr を介した抗生物質耐性に関する以前の研究でも使用されていたためです。 -機能不全のバイオフィルム40。我々は実験に MRSA 株 LAC (USA300) を使用しました。これは現在、黄色ブドウ球菌の病因研究で広く使用されている標準株です。 USA300 分離株は、米国における市中 MRSA の最も一般的な原因であり、病院関連の MRSA 感染の主な原因となっています46。

実験的なセットアップ。浮遊増殖のために、黄色ブドウ球菌 LAC の培養物を新しい TSB 培地に 1/200 容量で 9 日間毎日接種しました。レボフロキサシン (Lev)、バンコマイシン (Van)、またはクリンダマイシン (Cli) は 1/4 × MIC で供給されました。バイオフィルム増殖のために、黄色ブドウ球菌LACの培養物を前培養物からの1/200容量で、それぞれ200μlのTSBgを含むマイクロタイタープレートウェルに接種し、48時間増殖させてバイオフィルムを形成した。次に、上清を穏やかに除去し、Lev、Van、または Cli を含む TSBg 200 μl を 5 × MIC でウェルに分注しました。次の 9 日間、3 日ごとに古い上清を穏やかに除去し、新しい TSBg と置き換えました ( 200μl）とそれぞれの抗生物質。 b、c プランクトン (b) およびバイオフィルム (c) の成長の結果。寒天培地の機能不全は、羊寒天プレート上の溶血によって評価されました。 n = 3/グループおよび時点。エラーバーは平均値±SDを示します。統計分析は、ダネットの事後テストと対照値を使用した二元配置分散分析によって行われます。

この実験では、浮遊モード設定で培養物の 1/200 容量を新鮮な増殖培地に毎日接種することにより培養物を継代しました。バイオフィルムのセットアップでは、バイオフィルムは定量的に移すことができないため、マイクロタイタープレートのウェルで増殖させたバイオフィルムの上の上清を3日ごとに新鮮な増殖培地と交換しました。我々は、適用した抗生物質の阻害濃度以下がクオラムチーターの発生に重大な影響を与えることを発見しました（図1b、c）。さらに、プランクトン性とバイオフィルムの実験設定を直接比較することは確かに困難ですが、これらの抗生物質依存性の影響はより早期に現れ（すでに 3 日で、わずか 6 日で）、より顕著でした（3 ～ 9 日と比較して一貫して約 50% 増加）日の時間範囲）は、プランクトン性の成長モードよりもバイオフィルム内で成長します。

次に、実験感染中の抗生物質治療下でのクォーラム不正行為を分析するという主な目的に進みました。この目的のために、我々は再びLAC株（USA300）およびバイオフィルム関連および非バイオフィルム関連皮下皮膚感染症のマウス感染モデルを使用した（図2a）。デバイスの挿入を除けば、これら 2 つのモデルは非常に似ているため、デバイス (バイオフィルム) の関与の影響を比較する可能性が得られます。感染後 6 日目に抗生物質治療を開始し (皮膚膿瘍モデルとカテーテル感染モデルの両方)、24 時間ごとにさらに 2 回、合計 3 日間繰り返し、その後 CFU をカウントしました。抗生物質の影響を調査するために、我々は Van と Lev に焦点を当て、骨および関節感染症の臨床治療に推奨されるマウスの体重補正用量の約 1/8 に相当する低用量レジメンを使用しました 47。これは、デバイス関連の感染症の治療中に頻繁に遭遇する状況を模倣することを目的としており、デバイス関連のバイオフィルムの抗生物質に対する耐性が増加するために適用用量が抑制以下となり、結果として感染が持続するという状況を模倣することを目的としていました。低用量レジメンは、カテーテルに関連しない皮膚感染症との比較のためにも必要であり、より高用量ではすべての細菌が急速に死滅するであろう。

実験的なセットアップ。生後 6 ～ 8 週齢の雌の C57BL/6 を使用しました。抗生物質による治療では、感染後 6 日目からマウスに抗生物質を投与し (カテーテルおよび皮膚膿瘍モデル)、実験終了まで 3 日間 24 時間ごとに投与しました。対照には抗生物質を投与しなかった。マウスには、0.3 mg ml-1 Van (3.75 mg kg-1) を含む 0.25 ml の腹腔内注射、または 0.04 mg ml-1 Lev (0.8 mg kg-1) を含む 0.4 ml の経口投与を受けました。 1 つの感染タイプのすべてのマウスを同じ CFU で感染させました（皮膚膿瘍、約 1 × 107 CFU、カテーテル感染、1 × 103 ～ 104 CFU、実際の付着細菌数を検査しました。） b、c 黄色ブドウ球菌による感染で得られた結果抗生物質を使用した場合と使用しない場合の LAC 野生型。 d、e 黄色ブドウ球菌LAC野生型と同質遺伝子型Δagr変異体による感染で得られた結果。 f、g 抗生物質を使用した場合と使用しない場合の黄色ブドウ球菌 LAC Δagr による感染で得られた結果。 n = 6 (b、d、f); n = 8 (c、e、g)。 h PI または WGA-Alexa FluorTM 350 で染色した代表的な感染カテーテル片または対照 (感染なし) カテーテル片。統計分析は、ダネットの事後テストとデータを比較した一元配置分散分析 (b、f) またはクラスカルワリス (c、g) です。野生型対照、マン・ホイットニー検定 (d)、および対応のない両側 t 検定 (e) で得られます。パラメトリック検定とノンパラメトリック検定は、それぞれの比較におけるデータの正規分布 (Shapiro-Wilk) 検定に基づいて選択されました。エラーバーは幾何平均と幾何SDを示します。

意図したとおり、Van または Lev による治療は皮膚膿瘍モデルの CFU をわずかに減少させるだけであり、有意には減少しませんでした (図 2b)。対照的に、バイオフィルム関連皮下カテーテルモデルでは、抗生物質の追加により CFU が増加しましたが、これは Lev にとって有意でした (図 2c)。根本的な理由がクオラム不正行為とバイオフィルム媒介抵抗性に対するその影響に関連しているという仮説を立てて、我々はまず、構築された同質遺伝子型 QS (Δagr) 変異体と野生型 LAC の挙動を決定しました。以前に示したこと32によれば、Δagr変異体は皮膚膿瘍モデルにおいて感染力を強くかつ有意に低下させました（図2d）。これは、その設定で重要であることが知られているいくつかの病原性因子のAgrによる制御から予想されるとおりです。 PSM またはα-毒素として48,49。対照的に、Δagr株は、バイオフィルム関連カテーテル感染モデルにおいて野生型株よりも有意に高い感染力を示しました（図2e）。皮膚膿瘍モデルでは、Van 治療と Lev 治療の両方で CFU が大幅に減少しました（図 2f）。これは、使用した抗生物質濃度に対する in vivo 耐性が Δagr 株で大幅に低下していることを示しており、これは細菌の生存能力が大幅に低下したことの可能性が高い結果です。これらは、その設定における Agr の機能不全に関連しています 32,49。注目すべきことに、抗生物質治療と野生型黄色ブドウ球菌による感染で観察されたバイオフィルム関連カテーテル感染モデルにおけるCFUの有意な増加は、同質遺伝子型Δagr株では観察されず（図2g）、Agrクォーラムセンシングが機能していることを示唆しています。この現象と因果関係がある。また、カテーテルをPIまたはWGA-Alexa FluorTM 350で染色し、それぞれバイオフィルムの細胞外DNAまたは多糖を染色し、抗生物質がLACにおけるバイオフィルム形成を増加させるが、Δagr感染動物では増加させないことを確認した（図2h）。

短期間の実験 (6 日プラス 3 日) は、病因に関連する表現型が早期に発生する、バイオフィルムに関連しない皮膚感染症と直接比較できるように選択されました。ただし、カテーテル感染モデルにおける効果は感染後 9 (6 プラス 3) 日ではあまり顕著ではなく、図 2c に示す重要な比較において Lev についてのみ有意性に達しただけであるため、追加のカテーテル感染実験を実行しました。感染を延長し、6日プラス1日、3日、または9日の時点でサンプルを採取し、時間依存のデータを取得しました（図3a）。抗生物質治療下で感染力が増加する現象は時間の経過とともに進行し、Levでは3日目と9日目、Vanでは9日目に有意に達しましたが、野生型黄色ブドウ球菌ではなくΔagrに感染したマウスではまったく見られませんでした（図1）。 3b、c)。

実験的なセットアップ。マウスに 1 × 103 ～ 104 個の付着細菌 CFU を含むカテーテルを移植し、0.3 mg ml-1 Van (3.75 mg kg-1) を含む 0.25 ml を腹腔内注射するか、0.04 mg ml-1 Lev (0.8 mg kg-1) を含む 0.4 ml を経口投与しました。 mg kg-1) を感染後 9 日間毎日投与します。対照には抗生物質を投与しなかった。抗生物質による治療を開始してから 1、3、または 9 日目に、異なるマウスグループ (n = 6/グループ) を安楽死させました。 b、c 安楽死後のさまざまなグループのカテーテルの CFU。統計分析はマン・ホイットニー検定によるものです。エラーバーは幾何平均と幾何SDを示します。 d、e Agr (QS) 機能不全は、羊寒天プレート上の溶血によって評価されました。統計分析は、分析されたクローンの基礎となる生データ (溶血表現型) に基づく各時点でのフィッシャーの直接確率検定によって行われます。

さらに、カテーテル感染モデルで得られた結果を裏付けるために、追加のバイオフィルム関連感染モデルであるPJIモデルを使用しました（図4a）。このモデルでは、LAC感染動物と比較してΔagrのCFUの有意な増加も観察され、抗生物質治療下ではLACのCFUが増加したが、Δagr感染動物ではCFUの増加は観察されませんでした（Levで統計的有意性に達しました）（図4b-d）。

実験的なセットアップ。生後 6 ～ 8 週齢の雌の C57BL/6 を使用しました。抗生物質による治療では、感染後 14 日目から実験終了まで 7 日間、24 時間ごとにマウスに抗生物質を投与しました。対照には抗生物質を投与しなかった。マウスには、0.3 mg ml-1 Van (3.75 mg kg-1) を含む 0.25 ml の腹腔内注射、または 0.04 mg ml-1 Lev (0.8 mg kg-1) を含む 0.4 ml の経口投与を受けました。すべてのマウスを同じ CFU (50 μl 中に約 1 × 107 CFU、関節内注射) で感染させました。 b 抗生物質を使用した場合と使用しない場合の黄色ブドウ球菌 LAC 野生型による感染で得られた結果。 c 黄色ブドウ球菌LAC野生型と同質遺伝子型Δagr変異体による感染で得られた結果。 d 抗生物質を使用した場合と使用しない場合の黄色ブドウ球菌 LAC Δagr による感染で得られた結果。 n = 8。統計分析は、ダネットの事後検定と野生型対照 (b、d) および対応のない両側 t 検定 (c) で得られたデータを用いた一元配置分散分析です。エラーバーは幾何平均と幾何SDを示します。

QS の機能不全が、バイオフィルム関連モデルで抗生物質処理下で観察された感染力の増加の根底にあるという我々の仮説が正しければ、野生型黄色ブドウ球菌の感染中にクオラムチーターの発生が検出されることが期待されます。この仮説を確認するために、感染終了時の Agr 機能の読み取り値として分離株の溶血能力を測定しました。 Agr 機能不全変異体は、カテーテル (バイオフィルム以外) 関連の皮膚感染症ではいかなる条件下でも検出されませんでしたが、カテーテル (バイオフィルム) 関連の感染症では有意に高い割合で発現しました (表 1)。重要なことに、カテーテル関連感染症における Agr 機能不全変異体の発生率は、Lev または Van による治療下でさらに有意に増加しました。同様の観察が PJI モデルでも行われ、Lev または Van 処理なしでは Agr 機能不全変異体は観察されませんでしたが、Lev または Van 処理を行うと有意な割合で観察されました (表 1)。 agr変異体として解釈されるすべての非溶血性クローンは、Agrシステムに非同義変異を有することがDNA配列決定によって確認された(表2および3)。 in vitro または in vivo で発生する agr 変異について以前に報告されているように 32,40,41、変異は agrA または agrC 遺伝子にマッピングされています。興味深いことに、1 匹のマウスからの 2 つ以上の分離株で同じ変異が頻繁に検出され、agr 変異クローンの増殖が示されました。最後に、介入から 6 日プラス 3 日後の QS 変異体の割合はまだ低かったが、抗生物質による時間延長介入モデルでは、6 日プラス 9 日後に検出された QS 変異体の割合がかなり高かったことを強調することが重要です ( Lev > 10%; Van > 2% (全人口の) (図 3d、e)。マウスバイオフィルム関連感染モデルは、感染が治癒するため、それ以上拡張することはほとんどできません。それにもかかわらず、これらのデータは、バイオフィルム関連感染症の抗生物質治療中に QS 変異体が発生し、実質的に増殖する可能性があることを示しています。低用量の抗生物質で観察されたバイオフィルムの表現型は、理論的にはそれらの条件下での Agr 発現の減少によるものである可能性があるため、低用量の抗生物質治療が agr 発現の変化を引き起こすかどうかを分析しました。バイオフィルム感染部位の実際の in vivo 濃度を推定することは困難ですが、この目的のために、図 1c に示す in vitro 実験で使用した 5 倍の MIC 濃度を使用しました。我々は、使用した抗生物質濃度では最初の 1 日の時点で in vivo での増殖阻害が観察されなかったため、in vitro でこれらの濃度で観察された中程度の増殖阻害は、それらの濃度が in vivo で遭遇したものと少なくとも同じくらい高いことを示していると考えています。 agrA 遺伝子の qRT-PCR で測定したところ、Lev、Van、または Cli の 5 倍 MIC による agr 発現の阻害はありませんでした (補足図 2)。実際、3 つの抗生物質すべてについて、agr 発現はむしろ増加しました。

まとめると、我々の発見は、抗生物質治療がデバイス関連黄色ブドウ球菌感染症を悪化させる可能性があり、この現象が抗生物質耐性の増加を示すAgr機能不全変異体で構成されるバイオフィルムの発生頻度の増加と機構的に関連していることを示しています。

黄色ブドウ球菌および他の病原体が留置医療機器に定着して持続的な抗生物質耐性バイオフィルム感染を引き起こす例外的な能力は、主にバイオフィルムマトリックスの多糖類またはタンパク質をコードする遺伝子などの特定の遺伝子の存在に起因すると考えられています25、50、51。このようなバイオフィルム関連因子はバイオフィルム感染の開始と持続のための一定の前提条件であり、感染環境によってもその発現が変化する可能性があります 52 が、私たちの研究室などで行われた最近の研究は、デバイス関連感染が次のような動的なプロセスであることを示しています。このような感染症の進行に重要な役割を果たす遺伝的適応。具体的には、Agr QS システムの変異は、バイオフィルムを形成する傾向の増加により、黄色ブドウ球菌のデバイス関連感染中に発症し、その感染を悪化させる遺伝的適応を定義するものとして現在認識されており 31,32,34,40,53,54、これらの感染症からのそのような変異体34、39、41。

臨床機器関連感染は一般に抗生物質治療下で進行するため、本研究では、抗生物質治療が潜在的にクォーラム不正行為を刺激することにより、つまり agr 変異体の増加を刺激することによって機器関連感染に影響を与えるかどうかを直接調査することを目的としました。インビトロでは、抗生物質は、プランクトン性増殖様式よりもバイオフィルムにおけるクオラムチーターの早期かつより顕著な発生をもたらした。さらに重要なことに、我々は、低用量の抗生物質投与がバイオフィルム関連感染を悪化させ、それに付随するagr変異体の増加と増殖と関連していることを示した。

我々の発見は、バイオフィルム関連感染中に自然発生的に発生するAgr機能不全QS変異体の持続が抗生物質治療によって促進されるというモデル（図5に示す）と一致しています。私たちの以前の研究が示したように 32,40、agr 変異体で構成されるバイオフィルムは、抗生物質や白血球の攻撃に対する耐性が増加しています。したがって、臨床的バイオフィルム関連感染時の Agr 機能不全バイオフィルムの発生は、これら 2 つの機構の組み合わせによって及ぼされる選択圧によって説明される可能性があります。

当然のことながら、皮膚に定着した黄色ブドウ球菌は、挿入中に留置医療機器 (例として皮下カテーテルとして示されている) を汚染します。汚染細菌によるデバイスの初期定着が続きます。一部の細菌では agr 遺伝子座の自然突然変異が起こり、agr 機能不全の黄色ブドウ球菌が生成されます。抗生物質（バンコマイシン、レボフロキサシン）による選択圧下で感染が長期化すると、Agr 機能不全変異体が集団の野生型メンバーよりも増殖します。その結果、強力なバイオフィルムが形成され、抗生物質耐性と白血球攻撃に対する耐性が大幅に増加します。これはデバイス感染の悪化につながり、菌血症や全身播種を引き起こす可能性があります。

これらの発見は重要な臨床的意味を持っています。私たちの研究からの最も印象的なメッセージは、感染を根絶しない濃度での抗生物質治療（これはデバイス関連感染の場合に遭遇するまさに問題です）は、農業機能不全のクオラムチーター変異体の増加を引き起こし、それによって感染をさらに悪化させる可能性があるということです。感染症。

我々の研究には限界がある。研究には厳選された抗生物質のみを使用しました。しかし、(i) 選択した抗生物質は臨床で頻繁に使用される抗生物質をカバーしており、(ii) まったく異なる作用機序 (DNA 合成、細胞壁合成) を示しており、(iii) 抗生物質耐性があるため、結果は一般化できると考えています。バイオフィルム形成による影響は一般に非特異的であると認識されています。さらに、マウスバイオフィルムに関連した実験感染を維持できる期間には限界があるため、慢性臨床バイオフィルム感染で見られたクオラムチーターの完全な追い越しが観察されるまで感染を延長することはできませんでした40。しかし、2週間の感染中にマウスモデルで観察されたクオラムチーターのかなりの拡大を考慮すると、ヒトの長期感染で観察されるレベルまでさらに拡大すると考えるのが合理的であると考えられます。さらに、この研究の主なメッセージを表す抗生物質治療下の大幅な増加は、監視期間中にはっきりと確認できました。最後に、我々は、PSM に関連付けられている宿主細胞の細胞内生存など、持続感染における Agr 機能不全変異体の生存を促進するバイオフィルム形成とは関係のない追加のメカニズムが存在する可能性があることを認めています55。細胞内持続性は我々の研究では取り上げられていないが、小さなコロニー変異体や制御因子Rsp56、57など、Agr以外の因子と関連していると考えられており、これらに関連する変異は、バイオフィルム形成中に生じる変異をモニタリングした以前のヒト研究では同定されなかった。感染症40．

黄色ブドウ球菌 LAC (パルスフィールド型 USA300) は、NARSA (黄色ブドウ球菌における抗菌耐性ネットワーク) から入手しました。黄色ブドウ球菌 USA300 LAC の同質遺伝子型 agr 変異体は以前に記載されています 48。この変異体では、agr システム全体が欠失しており、RN691158 株からのファージ形質導入によって生成されています。すべての株を、30% グリセロールを添加したトリプシン大豆ブロス (TSB および BD) 中で -80 °C で保存しました。示されているようにさまざまな実験で主培養物に接種するために使用される前培養では、細菌を TSB を含む固体寒天プレート上で約 24 時間増殖させ、そこから単一クローンを接種に使用しました。浮遊培養物はTSB中で振盪条件(200rpm)下で増殖させ、バイオフィルム培養物はマイクロタイタープレート中でTSBg(TSBプラス0.5%グルコース)中で振盪せずに増殖させた。すべての細菌培養物は 37 °C で培養されました。

以前のいくつかの研究 32、39、41、45 と同様に、Agr 機能の読み取り値として羊血液寒天培地にプレーティングした際の溶血活性を使用しました。溶血能力を失ったほとんどの変異体は、Agr システムに自然発生的な変異を示すと報告されています 32,39,41,45。重要な in vivo 実験では、プライマー agrACforward (5'-GCTATACAGTGCATTTGCTAG-3') および agrACreverse (5'-TCGCAGCTTATAGTACTTGTG-3') を使用して、非溶血性クローンの agrA および agrC 遺伝子の配列を決定しました。

浮遊増殖モードでは、培養物を 15 ml 丸底チューブ内の TSB で 24 時間増殖させ、TSB のみ (対照) または TSB のみで前の培養物の 1/200 容量を使用して、新鮮な培養物を 9 日間毎日接種しました。レボフロキサシン (Lev)、バンコマイシン (Van)、またはクリンダマイシン (Cli) を 1/4 MIC で使用します。この研究で使用した抗生物質に対して LAC 株について測定された MIC は、1 μg/ml (Van)、4 μg/ml (Lev)、および 0.3 μg/ml (Cli) でした。 3、6、9 日目に、希釈液を羊血液寒天培地に播き、37 °C で一晩インキュベートした後、溶血を評価しました。バイオフィルム増殖モードでは、黄色ブドウ球菌LACの培養物を、前培養物から200μlのTSBgを含むマイクロタイタープレートウェルに1/200容量で接種し、48時間増殖させてバイオフィルムを形成した。次に、上清を静かに除去し、Lev、Van、またはCliを含むTSBg 200μlを5×MICでウェルに分注した。次の９日間、３日ごとに、古い上清を静かに除去し、それぞれの抗生物質を含む新鮮なＴＳＢｇ（２００μｌ）と置き換えた。

分離株の抗菌感受性は、臨床検査標準協会 (CLSI) のガイドラインに従って、ミュラー・ヒントン寒天培地上でのディスク拡散法によって測定されました。黄色ブドウ球菌ATCC29213を品質管理として使用しました。

RNA抽出試薬(Takara RR047A)を用いて黄色ブドウ球菌の全RNAを抽出し、RT試薬キット(Takara、RR037A)を用いて全RNAから相補的DNAを合成した。得られた相補的 DNA サンプルの増幅は、TB Green® Fast qPCR Mix (Takara、RR430A) を使用して実行されました。 7500 Sequence Detector (Applied Biosystems) を使用して、MicroAmp Optical 96 ウェル反応プレートで反応を実行しました。使用したオリゴヌクレオチドは次のとおりです (5'-3'): gyrB-F、CAAATGATCACAGCATTTGGTACAG、gyrB-R、CGGCATCAGTCATAATGACGAT、agrA-F、GCACATACCGCTTACAATTATTA、agr-R、ACACTGAATTACTGCCACGTTTTAA。

雌の C57BL/6 マウスを JSJ Corp. (元々は Jackson Laboratory から導入) から購入し、すべてのマウス実験に使用しました。すべてのマウスは、使用時に生後 6 ～ 8 週間でした。研究の最後に、すべての動物を CO2 によって安楽死させました。抗生物質治療実験では、感染後 6 日目 (カテーテルおよび皮膚感染モデル) または感染後 14 日目 (PJI) から実験終了まで 24 時間ごとにマウスに抗生物質を投与しました。対照には抗生物質を投与しなかった。 Van および Lev をそれぞれ 0.3 mg ml-1 または 0.04 mg ml-1 の濃度になるように水に溶解し、溶液をろ過滅菌しました。マウスには、0.3 mg ml-1 Van (3.75 mg kg-1) を含む 0.25 ml の腹腔内注射、または 0.04 mg ml-1 Lev (0.8 mg kg-1) を含む 0.4 ml の経口投与を受けました。研究者らは、CFU を決定する際にグループの割り当てについて知らされていませんでした。

皮膚膿瘍モデル。 50 μl の PBS 中の約 1 × 107 CFU の細菌を、毛を剃ったマウスの左および/または右脇腹に皮下注射しました。細菌量を測定するために、9日目の膿瘍を外科的に除去し、小片に切断し、500 mgのホウケイ酸ガラスビーズおよび500 μlの滅菌PBSを含む4つの別々のチューブに分割した。皮膚片を FastPrep 96 (MP Bio) ホモジナイザーで 1800 rpm で 5 × 1 分間ホモジナイズしました。次いで、ホモジネートをプレーティングし、37℃で24時間インキュベートし、計数した。

カテーテル感染モデル。カテーテル感染モデルは、基本的に以前に記載されているように実行されました 32。簡単に説明すると、1 cm のカテーテル片 (Surflo® テフロン iv カテーテル、14 × 2 インチ) を同数の細菌でコーティングしました。付着性は対照実験でテストされ、同じ範囲 (~ 1 × 103 ～ 104) でした。カテーテルは感染後 7、9、15 日目にカテーテルを皮膚から慎重に取り外し、検証された超音波処理プロトコールを実行した後、上記と同様に平板培養することによりカテーテルおよび直接隣接する組織上の CFU を決定しました。カテーテル上の細菌凝集体を破壊し、FastPrep 96 (MP Bio) ホモジナイザーを使用して組織サンプルを 5 × 1 分間均質化します。超音波処理プロトコールは、採取したカテーテルを 2 ml チューブ内の 1 ml PBS 中で 5 分間超音波処理することから構成されていました。クリーナー、続いて Vortex-Genie2 で 15 分間ボルテックス。感染後 9 日目に入手した一部のカテーテルも、0.1 M PBS 中の 2.5% グルタルアルデヒドで 30 分間固定し、その後 10 μM ヨウ化プロピジウム (Yeasen、上海) のいずれかで染色しました。 (細胞外 DNA の染色) 15 分間、または 2.5 μg/ml 小麦胚芽凝集素 (WGA)-Alexa FluorTM 350 (Invitrogen、W11263) (ブドウ球菌バイオフィルム外多糖の染色) 20 分間。次に、染色したカテーテルを PBS で洗浄し、黒いウェル壁と光学的に透明な環状オレフィン底部を備えた組織培養処理済みの 96 ウェル滅菌マイクロプレートのウェルに縦方向に置き、Agilent BioTek Lionheart FX 自動顕微鏡を使用して共焦点チャンネル ( PI 染色ブドウ球菌バイオフィルムには 555 nm レーザー、WGA 染色ブドウ球菌バイオフィルムには 350 nm レーザー)、4 倍の対物レンズを使用。

PJIモデル。 PJI モデルの場合、マウスは、以前に記載された外科的手法を使用して、1 ml BD インスリン注射器 (29 G × 1/2 インチ、0.33 mm × 12.7 mm) から 10 mm 注射針を使用して片側近位脛骨インプラント挿入を受けました 59。圧入インプラント挿入と関節切開閉鎖後、気密シリンジ (65 RN、Hamilton) を使用して、〜 1 × 107 CFU の細菌の 50 μl 関節内注射を行いました。CFU 投与の開始は、並行したシリンジ注射によって確認されました。羊血液寒天プレート上に 3 つずつ直接配置し、感染後 21 日目にマウスを CO2 で安楽死させ、注射針を使用して片側脛骨インプラント全体と直接周囲の組織をそれぞれ除去し、上記と同様に平板培養することにより CFU を測定しました。検証済みの超音波処理プロトコル (上記を参照) を実行して片側脛骨インプラント全体の細菌凝集体を破壊し、FastPrep 96 (MP Bio) ホモジナイザーを使用して組織サンプルを 5 × 1 分間均質化します。

統計分析は、Mac OS 用の GraphPad Prism バージョン 9.3.1 を使用して実行されました。分布の正規性に関するシャピロ・ワイルド検定、および一元配置または二元配置分散分析、またはクラスカル・ウォリス検定の結果に応じて、対応のない両側 t 検定またはマン・ホイットニー検定が 2 つのグループの比較に使用されました。、3 つ以上のグループの比較には、該当する場合およびシャピロ-ウィルク検定に応じて。使用した特定のテストは図の凡例に示されています。算術スケールの場合、エラーバーは標準偏差 (SD) を示し、線は平均を示します。対数スケールの場合、幾何平均と幾何 SD が表示されます。すべてのレプリケートは独立しています。

イラストは NIAID ライセンスに基づいて Biorender と Adobe Illustrator を使用して作成されました。マウスの写真は Vecteezy.com からのものです。

すべての動物実験は関連するすべての倫理規定を遵守し、中国上海市の上海交通大学医学部仁吉病院の倫理委員会によって承認されました（承認番号：KY2021-225-B）。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事または補足情報ファイルに含まれています。黄色ブドウ球菌 LACΔagr 株は、簡単な譲渡契約を条件として、Min Li 博士または Michael Otto 博士から入手できます。

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資金提供: この研究は、中国国立自然科学財団によって支援されました。 82272395および81974311（LHへ）、81873957および82172325（MLへ）、81772364（HSへ）]、上海浦江プログラム[助成番号2019PJD026（LHへ）]、上海科学技術院医療指導科学研究支援プロジェクト委員会 [助成金番号 19411962600 (HS へ)]、および国立アレルギー感染症研究所 (NIAID)、米国国立衛生研究所 (NIH) の学内研究プログラム [プロジェクト番号 ZIA AI001080 (MO へ)]。資金提供者は、研究の計画、データの収集、分析、解釈、報告書の作成、または出版のために論文を提出する決定において何の役割も果たしていませんでした。

上海交通大学医学部仁吉病院検査医学科、160 Pujian Road、Shanghai、200127、中国

Lei He、Huiying Lv、Yanan Wang、Qian Liu、Hua Wang、Min Li

上海交通大学付属第六人民病院整形外科、600 Yishan Road、Shanghai、200233、中国

フェン・ジャン、フェイヤン・チャン、ハオ・シェン

病原体分子遺伝学セクション、細菌学研究室、国立アレルギー感染症研究所、米国国立衛生研究所、50 South Drive、ベセスダ、メリーランド州、20814、米国

マイケル・オットー

上海交通大学医学部医学検査科学学部、227 South Chongqing Road、上海、200025、中国

ミン・リー

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概念化: MO 方法論: LH、MO、および ML 調査: LH、HL、YW、FJ、QL、FZ、および HW 可視化: LH および MO 資金調達: LH、HS、ML、および MO 監督: LH、HS、およびML ライティング - 原案: LH および MO ライティング - レビューおよび編集: LH、ML、および MO

Michael Otto または Min Li との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

He、L.、Lv、H.、Wang、Y. 他。抗生物質による治療は、クオラムチーターの発生を促進することにより、バイオフィルム関連感染を悪化させる可能性があります。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 9、26 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00394-4

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受信日: 2023 年 2 月 6 日

受理日: 2023 年 4 月 27 日

公開日: 2023 年 5 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00394-4

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