細菌

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休眠は、変動する環境での生活への適応です。 これにより、不利な条件にさらされた場合に、代謝活動が低下した可逆的な状態に入ることができます。 休眠は、生物に捕食者や寄生虫からの避難所を提供することで、種の相互作用にも影響を与える可能性があります。 ここで我々は、保護された個体のシードバンクを生成することによって、休眠が拮抗的共進化のパターンとプロセスを改変できるという仮説を検証する。 我々は、休眠内生胞子からなるシードバンクの存在下と非存在下で細菌宿主（枯草菌）とそのファージ（SPO1）を継代する、因子設計の実験を実施しました。 ファージが胞子に付着できないこともあり、シードバンクは個体群の動態を安定させ、休眠状態に入ることができない細菌と比較して最小宿主密度が 30 倍高くなりました。 我々は、ファージ感受性株に避難場所を提供することによって、シードバンクが、そうでなければ選択によって失われる表現型の多様性を保持していることを示す。 休眠状態には遺伝的多様性も保存されていました。 プールされた集団配列決定を使用して対立遺伝子の変異を特徴付けた後、ファージが存在するかどうかに関係なく、シードバンクには変異のある宿主遺伝子が 2 倍保持されていることがわかりました。 実験中の突然変異の軌跡に基づいて、シードバンクが細菌とファージの共進化を弱めることができることを実証します。 休眠は、環境変動に対して個体群を緩衝する構造と記憶を作り出すだけでなく、微生物群集の生態進化のダイナミクスにフィードバックできる方法で種の相互作用を変更します。

共進化は、2 つ以上の種の間の相互進化的変化から生じます。 共進化者の間では一般的ですが、共進化は宿主と寄生虫のダイナミクスを理解するための重要なプロセスでもあります [1]。 たとえば、拮抗的な相互作用には、行動的特性であれ形態的特徴であれ、宿主の適応度に対する寄生虫の悪影響を軽減する防御戦略の選択が含まれる傾向があります[2、3、4]。 次に、寄生虫は、宿主の防御戦略への投資を克服するために進化することがよくあります [5、6]。 これらの共進化の根底にあるメカニズムは、結合した個体群の多様性とダイナミクスに影響を与える生態進化フィードバックを引き起こす可能性があります[7、8、9、10]。 共進化の複雑さは、人口統計 [11]、交配システム [12]、栄養 [13]、生産性 [14]、分散 [15]、および生物の適応度に寄与するその他の形質によってさらに影響されます [16]。

共進化に影響を与える可能性のある形質の 1 つは休眠です。 変動する条件や次善の条件にさらされると、多くの生物は環境の合図を解釈し、それに反応して代謝的に不活性な状態に移行します。 生物は、代謝状態間を確率的に遷移することで、予測できない騒がしい環境でもリスクを回避することができます [17、18]。 どちらの戦略でも、休眠によって「シードバンク」として知られる非活動的な個体の貯蔵庫が作成されます。 休眠中の個体は生殖能力がありませんが、死亡率が低下します。 その結果、種子バンクは個体群の進化と生態に影響を与えます。 たとえば、シードバンクを使用すると、有効な集団サイズが増加するため、遺伝的浮動が減少します[19、20、21]。 さらに、種子バンクは、自然選択による除去を受けやすい集団内の個体を保持します[22、23]。 総合すると、種子バンクによって提供される遺伝的貯蔵は系統の絶滅を防ぎ、集団内の多様性の維持に貢献することができます[24]。

種子バンクはまた、共進化に影響を与える可能性のある方法で種の相互作用を変化させます。 休眠により、貯蔵効果を介して競合する種が共存できることが十分に確立されています。 この現象は、寿命が長いライフステージにより、不利な条件下での損失を最小限に抑えながら、有利な条件下で成長する種の能力を反映しています[25、26]。 同様に、シードバンクは、拮抗的に相互作用する種の動態を変化させます。 一方で、捕食者や寄生虫に間接的な利益をもたらすことで休眠状態が強化される可能性があります。 たとえば、甲殻類の動物プランクトン (Daphnia pulex) による静止構造の形成は、微生物資源の過放牧を制限し、捕食者と被食者のサイクルの振幅を減少させることができます [27]。 一方で、細菌からげっ歯類に至るまでの多様な分類群からの観察は、休眠状態が獲物に感染したり捕食したりする生物に対する避難場所を提供できることを示唆している[28,29,30]。 それにもかかわらず、一部の寄生虫は、生存と伝播を高める方法で宿主の休眠状態を利用しているようです[31、32、33]。 これらの観察は、宿主と寄生虫の動態の休眠と共進化の間の相互作用を調べる理論的研究に影響を与えたが、実証的な検証は不足している[34、35]。

何十年もの間、細菌とファージのコミュニティは共進化理論を検証するために使用されてきました [36]。 微生物株は、少量で数百から数千世代にわたって組み立て、複製、繁殖することができます。 短い世代時間と大きな個体群サイズにより急速な進化が可能になり、それは長期的なサンプリングによって追跡することができます[37]。 このような研究では、軍拡競争のダイナミクスと負の頻度依存選択のせいで、細菌とファージが共存することが多く、これは感染ネットワークとゲノム配列決定で実証されている[38、39、40]。 ウイルス防御戦略への関心の高まりは、細菌とファージの共進化について新たな洞察を得る機会を提供します[41]。 制限修飾や CRISPR-Cas などのウイルス防御の多くの形態は細胞内で発生しますが [42、43]、他の形態の耐性は細胞の表面で発生します。 後者の場合、選択の標的は、ファージ粒子の尾状構造が毛毛、鞭毛、リポ多糖、または細胞の外膜上に見られる他の受容体分子に付着する感染の初期段階と関連していることが多い[38、39、44]。 ]。 最終的に、細菌とファージの共進化は、ファージからの物理的または生理学的回避とともに、選択中の遺伝子座と進化した株の適応コストに依存します[45、46、47、48]。

微生物系は、休眠が共進化にどのように寄与するかをテストする手段も提供します。 休眠の最もよく理解されている形態の 1 つは内生胞子形成です [49]。 バチルスやクロストリジウムのような細菌は、資源の制限に直面すると、活発に成長する栄養細胞を代謝的に不活性で長寿命の休眠胞子に変える複雑な発生プロセスを経ます[50、51]。 内生胞子形成を制御する経路はよく特徴付けられており、遺伝子操作が容易であり、実験的進化試験で活用することができる[52、53]。 内生胞子形成は広範囲の環境ストレス因子に対する耐性を与える一方、ファージとの相互作用も変化させる可能性がある[54]。 例えば、ファージの付着に必要な受容体は、それを包む胞子被膜によって隠蔽されているため[55]、細菌が感染に対して耐性を持つ可能性がある。 それにもかかわらず、ウイルス寄生虫はこの休眠防御機構を克服できる可能性があります。 最近の研究では、一部のファージが内生胞子形成を阻害できる宿主由来の遺伝子を保有しており、この種の表現型可塑性によってもたらされる潜在的な避難場所を排除できることが実証されています [56、57]。

この研究では、胞子形成細菌 (枯草菌) とそのファージを使った実験を行い、休眠とその結果として生じるシードバンクが、共進化する宿主と寄生虫の生態進化のダイナミクスにどのような影響を与えるかをテストしました。 胞子形成に必須の遺伝子に変異を導入した後、種子バンクが感染率、個体群動態、群集の安定性にどのような影響を与えるかをテストしました。 実験のさまざまな時点から細菌を単離することにより、シードバンクの存在下および非存在下での宿主集団におけるファージ耐性表現型の維持を追跡しました。 プールされた集団配列決定を使用して、分子多様性のパターンと共進化の遺伝的特徴も定量化しました。

実験では細菌宿主としてBacillus subtilils 168 Δ6 (表S1)を使用しました。 モデル株B. subtilis 168のこの操作された誘導体は、そのゲノムからすべての既知のプロファージが削除されており、内生胞子を形成することができます[58]。 Δ6 株から、内生胞子形成に特異的であり、内生胞子形成に不可欠な遺伝子である spoIIE を欠失させることにより、非胞子​​形成宿主を操作しました (補足テキストを参照)。 spoIIEの欠失が適応性に影響を与えたり、ファージ感染を変化させたりしないことを確認しました（補足テキストを参照）。 胞子形成 (Δ6) および非胞子形成 (Δ6 ΔspoIIE) 細菌を、低塩 (5 g/L NaCl) を含む LB 培地または Difco 胞子形成培地 (DSM [59]) で培養しました。 培地は、改変バチルスが耐性であるクロラムフェニコール (5 μg/mL)、プレーティング用の寒天 (15 g/L)、およびファージの吸着を促進するための CaCl2 (LB で 10 mM、DSM で 1 mM) で修正されました。 実験ではファージSPO1を寄生虫として使用しました（表S1）。 この毒性ファージはヘレレウイルス科 [60] に属し、枯草菌やその他の桿菌に感染する代表的なウイルスのグループです [61]。 SPO1 は dsDNA ゲノム (132 kb) と、長い収縮尾と正二十面体の頭部を含むミオウイルス様の形態を持っています [62]。 SPO1 を増幅するために、ペトリ皿を pH 7.5 緩衝液 (10 mM Tris、10 mM MgSO4、4 g/L NaCl、1 mM CaCl2) で満たした後、プレート感染から溶解物を収集しました。 次に、遠心分離 (7200 × g、10 分間) および濾過 (0.2 μm) により、細菌からファージを含む緩衝液を除去しました。

宿主への付着を特徴付けるために、我々は吸着アッセイを実施し、時間の経過とともに胞子や栄養細胞に付着したファージ粒子の割合を定量しました[63]。 DSM での一晩培養で生成した胞子を、リゾチーム処理 (50 μg/mL、1 時間、37 °C)、その後の SDS 処理 (0.05%) および H2O での 3 回の洗浄によって精製しました。 発芽を防ぐために、発芽に必要な資源が不足しているトリス緩衝生理食塩水 (pH 7.5) に精製した胞子を再懸濁しました。 LB培地での一晩培養物から栄養細胞を回収し、これを洗浄し、トリス緩衝生理食塩水(pH 7.5)に再懸濁した。 吸着アッセイを開始するために、サンプリング前に 107 ～ 108 個の栄養細胞または精製胞子を約 104 個のファージ (感染多重度 = 10-3-10-4) と振盪インキュベーター内で 37 °C で 5 分間混合しました。 プラークアッセイによって未吸収ファージの力価を測定する前に、直ちにサンプルをろ過（0.2 μm）して細胞と吸着ファージを除去しました。 これには、0.3% 寒天オーバーレイによる二重層プレーティングが含まれていました [64]。 細胞を含まない対照フラスコを設定して、初期ファージ力価を測定しました。 ファージの存在量から吸着のパーセントを計算し、片側 t 検定を使用してこれらの値がゼロより大きいかどうかをテストしました。

我々は、シードバンクの存在下または非存在下で細菌とファージを連続継代する2×2因子設計実験を実施しました（図1）。 各実験単位について、Δ6 (+ シードバンク処理) または非芽胞形成 Δ6 ΔspoIIE (- シードバンク処理) の単一コロニーから開始した B. subtilis の一晩培養物 100 μL を 10 mL の DSM に接種しました。 ）。 実験単位の半分 (各シードバンク処理で n = 3) を非感染対照群 (ファージ) にランダムに割り当て、残りの実験単位には SPO1 の同質遺伝子溶解物から 106 プラーク形成単位 (PFU) を与え、多重度を達成しました。 0.0002（+ファージ）の感染。 処理が確立したら、すべての集団 (n = 12) を 50 mL 三角フラスコ内の DSM 10 mL に入れて、37 °C の振盪インキュベーター (200 rpm) 内で維持しました。

+ シードバンク処理では、成長によってリソースが使い果たされた後でも内生胞子を形成できる枯草菌株を使用しました (黒い矢印)。 さらに、内生胞子滞留時間を延長するために外部シードバンク (青色で表示) を確立しました。 このプロセスの最初のステップでは、熱処理 (火炎 = 80 °C、20 分) による内生胞子の精製を行い、フラスコに含まれる焦点集団から採取したサンプルからファージと栄養細胞を除去しました。 次に、これらの内生胞子を、同じ方法で得られた以前の移植から保存された内生胞子と混合しました。 この胞子混合物 (すなわち、外部種子バンク) と焦点集団から採取した未処理サンプルを使用して、新鮮な培地に接種し、次の移植を確立しました。 - シードバンク処理では、胞子形成に必須の遺伝子に操作された変異が原因で、リソースが枯渇した後、富栄養培地で内生胞子を生成することができなくなった枯草菌の変異株を用いて連続移入（黒矢印）を実施しました（スポIIE）。 最初の連続移入（t-1）でシードバンクを確立した後、集団の半分をファージSPO1に感染させることによってt0で実験を開始しました。 簡単にするために、非感染コントロールは示されていません。 詳細については、メソッドを参照してください。

DSM で増殖すると、Δ6 は急速に資源を枯渇させ、胞子形成を促進します。 たとえば、48 時間のインキュベーション後、内生胞子は集団の 65 ± 7% (平均 ± SD、n = 3) を占めました。 しかし、新鮮な培地に移した場合、これらの胞子は50％h-1の割合で発芽しました（図S1）。これは、集団が連続的に移入されるときに、過去の移入による休眠個体の蓄積を制限する可能性があります。 そこで、発芽を損なうことなく古い内生胞子と新しい内生胞子を混合できる、年齢構造の外部種子バンクを生成しました（図1）。 その後、外部種子バンクからの内生胞子を、実験における内生胞子の滞留時間を延長する方法で焦点集団に戻すことができました (補足テキストを参照)。 まず、細胞を回収し、遠心分離機（8000 × g、5 分間）で等量のリン酸緩衝食塩水（pH = 7.4）で 2 回洗浄し、胞子の発芽を引き起こす可能性のある残留培地を除去しました。 次に、内生胞子を単離するために、サンプルを熱処理してファージと栄養細胞を死滅させました (80 °C、20 分)。 各移植では、単離された内生胞子を、前回の移植からの種子バンク内生胞子と体積比 4:1 (新しいもの:古いもの) で混合することによって種子バンクに追加しました。 最後に、次のシリアル転送時に、この新たに混合した種子バンクのサンプルを焦点集団に戻しました (図 1)。

個体群の動態を追跡するために、細菌とファージを経時的に連続継代しました。 移すたびに、集団の 1% (100 μL) を新しい三角フラスコ内の新鮮な培地に等分しました (図 1)。 + シードバンク処理に割り当てられた集団については、総接種材料サイズを制御するために、未処理の集団サンプル 50 μL とシードバンク 50 μL を移しました。 各集団を 28 日間 1 日おきに移植し、合計 14 回の移植を行い、これは約 90 宿主世代に相当します。 集団サイズを定量化するために、各実験単位を毎日サンプリングしました (以下を参照)。 各移入時（48 時間）、表現型および分子進化の評価のために宿主およびファージ集団のサンプルを保存しました（以下を参照）。 細菌は、-80 °C で保存する前に集団サンプルにグリセロール (体積あたり 15% 体積) を添加することによって保存されました。 細菌の内生胞子を保存するために、外部シードバンクを 4 °C で保存しました。 ファージライセートを保存するために、5 mL のサンプルを遠心分離 (7200 × g、10 分間) によって除去し、上清を 0.1 mL のクロロホルムとともに 4 °C で保存しました。

我々は、核酸染色SYBRグリーンの取り込みの違いに基づいて内生胞子を栄養細胞（非胞子）から区別するフローサイトメトリーアッセイを用いて細菌密度を定量した[65]。 力価が既知の祖先ファージライセートの段階希釈から作成した標準曲線と並行して、SPO1特異的プライマーを使用した定量的PCR（qPCR）アッセイを使用してファージ密度を定量しました（表S2）。 得られたデータを使用して、線形混合効果モデル (R パッケージ nlme v3.1) で実装された反復測定 (RM)-ANOVA を使用して、ファージ処理、シードバンク処理、および時間の主な効果と高次相互作用をテストしました。 -149 [66])。 仮定を満たすために、Box-Cox 法 (R package car v3.0-10 [67]) を使用して生の存在量データを変換しました。 長期にわたる母集団の繰り返しサンプリングにおける独立性の欠如を説明するために、赤池情報量基準 (AIC) に基づいて選択されたパラメーターを備えた自己回帰移動平均相関構造 (corARMA(p,q)) を組み込みました。 治療の組み合わせ間の違いを特定するために、emmeans R パッケージ (v1.5.1 [68]) を使用した RM-ANOVA モデルの推定周辺平均に基づいて事後分析を実施しました。 詳細については、補足テキストを参照してください。

シードバンクがファージ耐性の進化にどのような影響を与えるかをテストするために、祖先ファージによる感染に対するさまざまな時点の細菌の感受性を特徴付けました。 私たちのアッセイには、ピンレプリケーターを使用して、祖先SPO1の表面に広がったDSMプレート上に混濁した細菌培養物をスポットすることが含まれていました（図S2）。 対照として、ファージを含まない DSM プレート上に同じクローンをスポットしました。 両方のプレート上で増殖できた細菌クローンは耐性としてスコア付けされ、ファージの非存在下でのみ増殖したクローンは感受性としてスコア付けされました。 私たちは、祖先ファージに対する共進化実験の最初の 4 回の移植中に保存されたサンプルから単離された細菌クローン (集団あたり n = 22) に挑戦しました。 種子バンクから復活させたクローンを同じ方法で試験しました (集団あたり n = 22)。 我々は、上記のようにRM-ANOVAを使用して、祖先ファージに対する耐性の進化に対する種子バンク処理とクローン起源（総集団対種子バンク）の影響を試験しました。

我々は、プール集団シーケン​​スを実行して、シードバンクとファージ処理が細菌とファージ集団の分子進化動態にどのような影響を与えるかを評価しました。 共進化実験の連続転送 1、4、7、10、および 14 の最後にゲノム DNA を抽出しました (補足テキストを参照)。 ペアエンドライブラリーは、ファージについては 2 × 38 bp リード、細菌については 2 × 150 bp リードを含むターゲット最小カバレッジ 100 で構築されました。 配列決定は、NextSeq500 シーケンサー (Illumina) を使用して実行されました。 突然変異とその頻度は、多型モードで breseq [69] を使用して呼び出されました。 適応度に最も大きな影響を与える可能性のある変異に焦点を当てるために、分析を非同義の変異、挿入、および欠失に限定しました。 経時的な変異頻度の軌跡は、少なくとも 3 つの時点で検出された変異についてのみ考慮されました。

細菌の遺伝的多様性に対するファージおよびシードバンク処理の効果を比較するために、各集団における各遺伝子の多重度 (m) を計算しました [70]。 私たちの実装では、多重度は、遺伝子の長さに応じて遺伝子内で観察される突然変異の数を標準化し、遺伝子および集団間の比較を可能にします。 固定事象がほとんど観察されなかったことを考慮して、ゼロを除いたその遺伝子内のすべての突然変異の頻度の中央値によって遺伝子の多重度を重み付けしました。 j 番目の集団における i 番目の遺伝子の多重度 (m) は、 \(m_{i,j} = \frac{{\bar L}}{{L_i}}\mathop {\sum }\nolimits_{k) と定義されます。 \in i} f_{med\,j,k}\)、Li は i 番目の遺伝子の非同義部位の数、\(\bar L\) はすべての遺伝子の非同義部位の平均数、fmed j ,k は、集団 j の遺伝子 i における突然変異 k の時間に対する頻度の中央値です。 集団間で獲得された突然変異の総数の違いを説明するために、すべての遺伝子の m の合計で m を正規化しました。 \(\tilde m_{i,j} = m_{i,j}/\mathop {\sum } \nolimits_i m_{i,j}.\) 治療ラベルを並べ替えることによって得られた p 値を使用して、2 サンプルのコルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して、治療間の相対多重度の分布を比較しました。 最後に、Bray-Curtis 距離による主座標分析 (PCoA) を使用して、治療間で変異のある遺伝子の構成を比較しました。 ユークリッド距離と 10,000 個の順列を使用して、vegan v2.6-2 [71] の adonis2 関数を使用して、上位 5 つの主座標 (90% 以上の変動を説明) に PERMANOVA を使用しました。 PERMANOVA の結果により、シードバンクとファージ処理の主な効果と、変異遺伝子組成に対するそれらの相互作用をテストすることができました。

共進化がシードバンクによってどのように影響を受けたかを判断するために、我々は、宿主とファージの突然変異軌跡間の相関を経時的に定量化した[72]。 我々は、対応する宿主集団とファージ集団における突然変異軌跡のペア間のピアソン相関係数を計算しました。 ゼロの不当な影響を最小限に抑えるために、宿主集団とファージ集団の両方で非ゼロ頻度の観測値が 3 つ未満の軌跡ペアは削除されました。 ヌル分布 (つまり、共進化なし) を取得するために、前述したように、相関係数を計算する前に、観察された軌跡の時間ラベルをランダムに並べ替えました。 分布間のすべての比較は、治療ラベルを並べ替えることによって得られた p 値を使用した 2 サンプルのコルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して実行されました。 詳細については、補足テキストを参照してください。

胞子形成には細胞表面の変化が含まれており、これによりファージの付着が減少すると我々は予測しました。 SPO1 ファージは、精製された内生胞子に吸着できませんでした（図 2; 1 サンプル t 検定、t3 = −1.8、p = 0.91）。 対照的に、SPO1 ファージの > 66% は、アッセイの最初の 5 分以内に同じ細菌遺伝子型によって生成された栄養細胞に付着しました (1 サンプル t 検定、t3 = 15.3、p = 0.0003)。これは吸着率 4.63 に相当します。 ( ± 3.07) × 10−9 mL−1 分−1。

我々は、ファージSPO1が野生型枯草菌の内生胞子に付着できないことを実証する。 吸着パーセントは、精製内生胞子または栄養細胞のいずれかと混合したときの5分間にわたる遊離ファージの減少から計算されました。 4 つの生物学的複製の平均 (○) と標準偏差 (●) を示します。 灰色のバーは、各宿主細胞タイプの片側 t 検定の 95% 信頼区間の下限を示します。

休眠避難所が拮抗的共進化にどのような影響を与えるかをテストするために、外部シードバンクの存在下または非存在下で、枯草菌宿主にSPO1ファージをチャレンジする連続転移実験を実施しました（図1）。 株の遺伝学、増殖培地、および移入方式の組み合わせは、実験期間中高い胞子形成レベルを維持するのに効果的でした。 たとえば、 + シードバンク処理では、移植時に内生胞子の存在量が栄養細胞の存在量を超えることがよくありました (図 S3)。 シードバンク処理により、ファージが宿主動態にどのように影響するかが変化しました（RM-ANOVA; ファージ x シードバンク x 時間、F28、224 = 2.2、p = 0.0009、図 3）。 シードバンクがない場合、最小の宿主密度で、ファージ感染により、非感染対照と比較して細菌集団サイズが15倍減少しました（時系列の推定周辺平均に基づく事後比較、t8 = 10.6、p < 0.0001）。 (8.5 × 105) は実験の初期 (5 日目) に発生しました。 シードバンクを使用した場合、ファージ感染は、最小宿主密度（3.2 × 107) 実験の後半 (13 日目) に発生します。 シードバンクはまた、ファージによって誘発される宿主密度の変動を安定させました（推定周辺平均に基づく事後比較、t268 = 3.0、p = 0.031）。 この効果は、ファージが宿主集団密度に最も大きな影響を及ぼした実験の初期段階で最も顕著でした（図S4）。 実験の途中 (14 日目)、両方のシードバンク処理でファージによって引き起こされる細菌密度の変動が抑制されました。 ファージがなければ、シードバンクは細菌密度に影響を与えませんでしたが（t8 = 1.2、p = 0.28、図S4）、実験全体を通じて集団の安定性は増加しました（t268 = 12.5、p <0.001、図S4）。

細菌とファージの動態は、2 日ごとの連続移入によって増殖した反復 (n = 3) 集団で追跡されました (図 1 を参照)。 + シードバンク処理では、宿主は胞子形成する可能性があります。 シードバンク処理では、宿主には胞子形成を妨げる操作された突然変異がありました。 ファージ SPO1 を、0 日目に + ファージ処理のすべての集団 (フラスコ) に添加しました。 - ファージ処理および + ファージ処理におけるさまざまな宿主株の集団動態を比較するには、図 S5 を参照してください。 データは平均値 ± SEM として表されます。

シードバンクがファージ耐性の進化にどのような影響を与えるかを評価するために、時間をかけて複製集団から単離した細菌の祖先ファージに対する宿主の感受性を定量化しました。 シードバンク処理では、ファージの感受性は検出以下の頻度まで急速に低下しました。 最初の移入時までに、感受性のある宿主は、集団のほぼ 100% を占める耐性菌に置き換えられ、残りの実験ではこの頻度が維持されました (図 4)。 同様の傾向が、移植前に全集団 (栄養細胞 + 内生胞子) からサンプリングされたクローンに対する + シードバンク処理でも観察されました (RM-ANOVA、F1、4 = 1.1、p = 0.354)。 しかしながら、外部シードバンクにおけるファージ感受性は、全集団のファージ感受性とは大きく異なっていた(RM-ANOVA、F1、14 = 12.5、p = 0.003)。 具体的には、感染前シードバンクからの内生胞子の希釈率を考慮すると、予想されるものよりもシードバンクからのより多くのクローンが感受性がありました（図4）。 この発見は、ファージ耐性が宿主集団を支配している場合でも、感受性の宿主はウイルスの存在下で複製し、胞子形成することができたことを示唆している。

我々は、枯草菌のクローンを祖先ファージに対して攻撃することにより感受性を定量化した。 + シードバンク処理と - シードバンク処理の両方で、連続移入の直前にフラスコ (図 1) に含まれる各焦点集団から単離されたクローン (n = 22) に対してこのアッセイを実行しました ()。 さらに、各時点で外部シードバンク（図1）からクローン（n = 22）を復活させ、それらを祖先ファージに対して挑戦させました（）。 感受性クローンの予想パーセンテージ () は、感染前の外部シード バンクに由来するクローンの連続移入によって引き起こされる希釈損失に基づいています (補足情報を参照)。 データは反復母集団の平均 ± SEM として表されます (n = 3)。

細菌集団における宿主の遺伝的変異（つまり、対立遺伝子）の分布は、シードバンク処理によって大幅に変化しました（図5）。 遺伝子長によって重み付けされた遺伝子ごとの非同義突然変異の数と突然変異の頻度の両方を説明する遺伝子多重度を調べると（図5a）、シードバンクで進化した集団は、進化した集団よりもおよそ2倍の突然変異を持つ遺伝子を持っていました。シードバンクなしで。 種子バンクからの追加の遺伝的多様性により、多重度スコアの裾が長くなりました（図5b）。

a 突然変異は配列決定によって特定され、影響を受ける遺伝子にマッピングされました。 遺伝子の多重度は、その長さを考慮した遺伝子内で観察される突然変異の数を反映し、集団内のそれらの突然変異の頻度によって重み付けされます。 同じ長さの遺伝子 (遺伝子 A、B、および C) が与えられた場合、高い多重度は、集団内の高い突然変異頻度 (遺伝子 A)、複数の突然変異部位 (遺伝子 B)、またはその 2 つの組み合わせから生じる可能性があります。 b 集団間の比較では、各集団の多重度の合計を 1 に正規化して相対多重度を計算しました。 各曲線は、単一集団の多重度値を減少させることによってランク付けされた相対的な遺伝子多重度を表します。 実線は + ファージ処理からの集団 (n = 3) を表し、破線は - ファージ処理からの集団 (n = 3) を表します。 多重度の分布に対するシードバンクの影響は、順列コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して決定されました。

遺伝的多様性に対する種子バンクの影響は、突然変異を伴う細菌遺伝子の構成にも反映されました。 集団間の対立遺伝子変異の 70% 以上はシードバンクに起因すると考えられます (図 S6. PERMANOVA F1,8 = 65.3、p < 0.0001)。 種子バンクには、幅広い機能に関与する遺伝子の対立遺伝子変異体が保存されていました（表S3、補足説明）。 例えば、宿主突然変異の序列プロットにおいてシードバンク処理と有意に相関する遺伝子は、ストレス応答（例：fluC、yhdN、yceH）、細胞壁合成（例：dacA、ylmD）、および遺伝子発現の調節に関連していた。 (例: yrdQ)。 対照的に、シードバンク処理は、ファージ集団における対立遺伝子変異体の分布（図S7）や変異遺伝子の組成（図S8）には影響を与えませんでした。

ファージは宿主変異の組成にも影響を与えました（図6およびS6、PERMANOVA F1,8 = 6.1、p = 0.022）。 ファージ感染集団で高頻度（> 0.3）に達したほぼすべての変異は、テイコ酸生合成に関与する遺伝子にありました。 テイコ酸はグラム陽性菌の細胞壁に見られるポリマーで、ファージ SPO1 が付着するために使用されます [61]。 + ファージ処理におけるすべての複製集団は、テイコ酸経路の 4 つの遺伝子 (pcgA、tagD、tagF、および gtaB) の少なくとも 1 つに高頻度の変異を持っていました (図 6 および S9)。 これらのうち、tagD および pcgA 変異は別個の集団で独立して発生し、宿主変異の順序プロットにおいてファージ感染と有意に相関していました (表 S3)。 pcgA 変異のほかに、ファージに感染したシードバンクを持つすべての集団は、バイオフィルム形成の sinR リプレッサーに高頻度の変異を持っていました。 ファージが存在しない場合、すべての集団は opp オリゴペプチド輸送体システムの単一遺伝子 (oppD) に高頻度の突然変異を持ち、6 つの集団のうち 4 つはリン酸レイキナーゼ kinA に高頻度の突然変異を持ちました (図 S9)。 シードバンクがなければ、宿主には、opp オペロンの複数の遺伝子や、好気性呼吸と嫌気性呼吸を制御するセンサーキナーゼである resE の遺伝子など、より多くの高頻度変異が存在していました。 ファージ集団における高頻度の突然変異は、シードバンク処理に関係なく、主に尾部構造遺伝子 (gp15.1、gp16.2、gp18.1、gp18.3) をコードする遺伝子にありました (図 6)。 B. subtilis を用いた以前の研究では、gtaB の変異によって引き起こされる SPO1 に対する耐性は、尾繊維遺伝子 gp18.1、gp18.3、および gp16.2 の変異によって克服できることが実証されました [61]。

ファージに感染したコミュニティにおける変異対立遺伝子の頻度の軌跡 (a) シードバンクなし、および (b) シードバンクあり。 各行は、単一コミュニティのホストとファージのデータを示します (右側の数字)。 頻度 >0.3 に達した非同義変異は、それが発生した遺伝子によって色分けされます。 高頻度の突然変異を持つ遺伝子の名前が集団ごとに提供されます。 遺伝子の詳細については、表 S4 を参照してください。 c - シードバンク処理では、宿主とファージの変異軌跡間の相関係数の分布は、時間ラベルを並べ替えることによって得られたヌル分布と比較して負に偏りました。 + シードバンク処理では、分布はヌルの分布に似ていましたが、低相関ペアがわずかに過剰であり、宿主ファージの共進化動態のシードバンク緩衝作用と一致していました。

共進化がシードバンクによってどのように影響を受けたかを判断するために、我々は、宿主変異とファージ変異の経時的軌跡間の相関関係を定量化した[72]。 宿主とファージが互いに相互選択を課した場合、2 つの集団の分離変異間に強い相関関係があることが予想されます。 シードバンクがない場合、順列化によって得られたヌル分布と比較して、過剰な負の相関がありました（図6c）。 シードバンクを使用すると、観察されたペアワイズ相関の分布はヌル分布とは依然として大きく異なりましたが、その形状は片側に偏ることはなく、全体的にヌル分布の均一な形状により似ていました（図6c）。 シードバンクがある場合とない場合の宿主とファージの変異軌跡間のペアワイズ相関の分布は、互いに有意に異なりました（コルモゴロフ-スミルノフ検定、D = 0.151、p < 0.0001）。 まとめると、我々の分析は、ファージと宿主の突然変異軌跡の間の相関が、休眠によって弱まった共進化の動態と一致して、シードバンクによって弱められたことを示している。

私たちは、宿主関連生態系および環境生態系における細菌の存続と拡散に重要な影響を与える休眠形質である内生胞子形成を操作することにより、シードバンクが細菌とファージ集団間の共進化動態にどのような影響を与えるかを実験的にテストしました。 吸着率を変化させ、種子バンクを作成することにより、胞子形成はファージ感染に関連する細菌の死亡率を減少させました。 これにより、集団動態が緩衝され、ファージ感受性の表現型が保存され、宿主集団内の低頻度の突然変異が保持されました。 選択の標的であることが知られている遺伝子における高頻度の突然変異が、宿主集団とファージ集団の両方で繰り返し発生しました。 突然変異の軌跡の分析を通じて、我々のデータは、シードバンクが細菌とファージ集団間の拮抗的共進化の強さを弱めることができる物理的保護と生物学的記憶[17]を提供することを示唆している。

胞子形成は、細菌が変動する環境で存続できるようにする複雑な形質です。 我々は、胞子形成がファージ感染からの避難場所にもなることを実証した。 ファージ SPO1 は、おそらく胞子の細胞表面の修飾のため、内生胞子に付着できませんでした (図 2)。 内生胞子は、ファージが宿主細胞を認識して付着するために使用する受容体をマスクできるタンパク質に包まれています。 さらに、この胞子コートは、多くのファージが宿主細胞に侵入するために使用する溶解酵素[73]などの溶解酵素から細胞壁を保護します。 一時的ではありますが、胞子形成には他の形式のファージ防御と比較していくつかの利点があります。 例えば、これにより宿主はファージ耐性突然変異に関連するコストを回避できると同時に、複数の、あるいは場合によってはすべてのファージに対する広範な保護を提供できる可能性があります。 保護はおそらく、不適合な結合によってもたらされるだけでなく、厚い胞子コートの浸透に関連する物理的攻撃によっても与えられる[47、74、75]。 我々はファージに対する防御を実証しましたが（図2）、一部の捕食者（原生生物など）が内生胞子を消化できないことを考慮すると、防御はさらに拡大する可能性があります[28]。 これらの見落とされがちな特徴は、胞子形成細菌が地球上で最も豊富な細胞型の 1 つである理由を説明するのに役立つ可能性があります [76]。 ただし、種子バンクの避難所は内生胞子形成に限定されません。 他の形態の休眠も、細菌、藻類、植物、後生動物の休止期を含む、病原体や捕食者に対する耐性を提供します[55、77、78、79、80]。

ファージは細菌に対して強いトップダウンの圧力を及ぼし、その結果、複雑な生態進化のダイナミクスが生じることがよくあります[8、81]。 実験室での共進化研究（例えば4）で一般的に観察されるように、感染後の1回の転移内で、ファージ耐性が宿主集団全体に広がった（図3）。 しかし、最初の転移では、どの感染集団においても宿主集団を支配する単一の遺伝子型は存在しませんでした（図6）。 したがって、ファージによって課せられた強力な選択に対する表現型の応答は、遺伝子の多様化によって達成され、その後、特定の遺伝子型が宿主集団内で固定されたときにのみ除去されました。 その遺伝的根拠に関係なく、ファージ耐性の急速な進化により、バチルスは最初の移入の終わりまでに回復し、非感染集団に匹敵する密度に達することができました（図S5）。 感受性のある宿主の頻度が低いにもかかわらず、ファージ集団のサイズは依然として高いままでした。 このパターンの説明の 1 つは、耐性菌に感染できるファージ変異体が進化したということです。 これを裏付けるために、我々は、宿主受容体（テイコ酸）および耐性破壊に関与するファージ尾部成分に関連する突然変異の頻度の増加を記録した[61]。 まとめると、我々の研究で回収された変異は、共進化の特徴的な標的と関連している[38、44]。

シードバンクは宿主ファージの動態を大きく変化させた。 2 回目の移入後、感染した宿主集団のサイズは大幅に減少し、その効果は実験の残りの期間にわたって持続しました (図 3)。 シードバンクが存在しない場合、ファージ感染により細菌密度がより大きく、より急速に減少しました。 このファージの効果は、種子バンクの存在下では顕著ではありませんでしたが、これはおそらく宿主集団内の無敵の内生胞子によってもたらされる一人当たりの死亡率の低下によるものと考えられます。 さらに、種子バンクは、連続継代中に資源状態の変動を経験した細菌集団を安定化させたと考えられます。 各移植後、ほとんどの内生胞子が発芽しました。 これらの個体は、保護されておらず活動的な細胞であるため、ファージ感染に対してより脆弱になりました。 翌日の移動前に、資源の枯渇が胞子形成を開始する合図として機能します。 + ファージ処理では、栄養細胞と同等またはそれを超える内生胞子密度が得られました (図 S3)。 このような発見は、無敵の獲物の形での避難所が捕食者と被食者のサイクルの振幅を減らすことができるという予測と一致しています[75、82、83、84]。

胞子形成はファージ防御としてバチルス属にとって有益ですが、我々の発見は、いくぶん直観に反しますが、胞子形成がファージ集団の存続を促進する可能性があることを示唆しています。 シードバンクでは、感受性のある宿主はより長い期間にわたってより高い頻度を達成しました（図4）。 感受性のある宿主を蘇生すると、より多くのファージの再生が可能になり、ウォッシュアウトや粒子の崩壊による損失が相殺されるはずです。 さらに、種子バンクが存在しない場合、特に強いボトルネックがある場合（連続移動事象など）、まれな感受性宿主は局地的に絶滅するリスクが高くなります[85、86]。 その結果、シードバンクは実際に、共進化にとって重要なファージ多様性の生成をサポートする可能性があります。 実際、耐性を破壊する変異体は、耐性宿主と感受性宿主の両方を含む集団で出現する可能性が高くなります[87、88]。 全体として、シードバンクは、宿主集団を安定化し、感受性の高い宿主の部分集団を維持することによって、部分的には、共進化に必要なファージ変異体の増加を通じて、宿主と寄生虫の共存を促進する可能性がある。

予想と一致して、私たちの実験では、種子バンクが遺伝的多様性を維持していることが明らかになりました。 ファージに感染しているかどうかに関係なく、シードバンクを持つ集団では対立遺伝子変異が検出された遺伝子の数は約2倍でした（図5）。 私たちの集団は単一コロニーから開始されたため、観察された宿主の遺伝的多様性は実験の過程で新たに生成されたに違いありません。 + シードバンク処理における変異遺伝子の数の増加は、細菌密度が両方のファージ処理で類似していたという事実によって証明されるように、単に細菌の集団サイズが大きくなった結果ではありませんでした（図S5）。 同様に、多様性に対するシードバンクの効果は感染宿主集団と非感染宿主集団で観察されたため、変異遺伝子の違いはファージによって促進される多様化に起因するものではない[89]。 むしろ、我々の結果は、遺伝的蓄積効果と一致しており、そうでなければ遺伝的浮動またはネガティブ選択によって失われていたであろう希少な対立遺伝子が細菌集団内に保持されている。 ここで個体群レベルで記録された多様性への影響は、種子バンクを持つ群集における種の豊富さと希少性の増加の期待に類似しており、これは微生物系で観察される尾の長い種の豊富さの分布を説明することが示唆されています[17、90]。 遺伝的多様性の保持はファージ感染力学によるものではありませんが、細菌とファージの共進化に影響を及ぼします。 まず、宿主の多様性が高まると、寄生虫集団の拡散が妨げられる可能性があります [91、92]。 第二に、獲物の多様性は、捕食者とその獲物のダイナミクスと安定性に影響を与えるフィードバックを生み出す可能性があります[93]。 種子バンクは、寄生虫からの避難所を提供することで集合的に動態を安定させ、宿主個体群の多様性を高めることができ、それが共進化に直接的な影響を及ぼします。

共進化する細菌とファージのコミュニティでは、相互選択により、時間の経過とともにファージと宿主の遺伝子型の間に相関関係が生じるはずです。 シードバンクがない場合、宿主とファージの派生対立遺伝子間の関係は、強い負の相関を伴う偏った分布をもたらすことがわかりました（図6c）。 シードバンクを使用すると、ファージ内の分離対立遺伝子と宿主集団の間の相関関係が大幅に弱くなりました。 このようなデカップリングは、シードバンク避難所による宿主変異体に対するファージ選択の減衰を反映している可能性があります。 しかし、シードバンクは、過去の稀な変異体がより適応した条件下で蘇生できるようにすることで進化を加速する可能性も秘めている[94]。これは生物学的記憶の一形態である。 例えば、宿主耐性変異は、細菌とファージの共進化の軌道を上昇させて変える前に、低頻度で潜んでいる可能性がある[95]。 これらのいわゆる「リープフロッグダイナミクス」が生じると、優勢な宿主と寄生虫の遺伝子型が時折入れ替わることによって共進化が進行します。 多くの実験室ベースの進化研究では、宿主とファージの間の相互選択が軍拡競争を引き起こし、それには固定化につながる激しい一掃が伴う[38、39、89]。 時間の経過とともに、個体群が多様化し、抵抗力と反抵抗力に関連するトレードオフを経験するにつれて、これらの生態進化のダイナミクスは顕著でなくなる傾向がある[46、96、97]。 シードバンクは、多様性を維持する別の手段を提供します。これは、安定化された動態（図3）と突然変異軌跡の減衰した相関関係（図6）の観察に基づいて、細菌とファージの相互作用を緩衝する可能性があります。 共進化に対するシードバンクの最終的な影響を解明する今後の取り組みでは、分離株ベースの感染ネットワークの表現型データと宿主および寄生虫集団のゲノム解析を組み合わせる必要がある。

外部シードバンクを使用すると、集団の世代が重なった場合に現れる他の生態学的および進化的現象を調査できます。 サイズや年齢構造などのシードバンクの重要な特徴は、外部シードバンクのサンプル量と混合比を変更することで実現できます。 このアプローチは原則として微生物での使用に適していますが、凍結保存や凍結乾燥などにより個体を代謝停止状態で保存できるあらゆる分類群での使用に適しています。 このような戦略により、複雑な生活史と人口動態および進化を統合する理論をテストするための実験の計画が可能になる可能性があります (たとえば、[94])。 このアプローチはこれまで実装されていなかったため、私たちの実験は、制御され再現された方法でシードバンク理論の基本的な期待をテストするように設計されました。 その結果、腸や土壌などの環境で一般的な種子バンクと共進化の複雑さの多くは、今回の研究では明確に捉えられていませんでした。 それにもかかわらず、外部種子バンクは、土壌中の植物種子や堆積物中の植物プランクトン嚢胞など、代謝的に活動的な個体とは空間的に異なる休眠個体がパッチに存在する天然の種子バンクと類似性を持っています[98,99,100]。

ここで説明したような実験は、シードバンクの進化生態学に関連する他の疑問を探求するために拡張される可能性があります。 たとえば、シードバンキングは宿主集団に限定されません。 休眠段階を持つ寄生虫も一般的であり、一部のシステムでは宿主と寄生虫の両方がシードバンクを形成します。 さらに、シードバンク理論は、溶原性や潜伏期などのウイルスの休眠形態に関連する生殖と生存のトレードオフを理解するために使用できる可能性があります。 このような条件下で発生する可能性のある複雑さに取り組むにはさらなる研究が必要ですが、既存の理論は、宿主-寄生虫システムの休眠がシードバンキング自体の進化にフィードバックできることを示唆しています[34]。 たとえば、私たちの研究システムでは、種子バンクの避難所は、数百の遺伝子が関与する複雑な形質である内生胞子形成の維持に貢献する可能性があります。 胞子形成細菌が良好な環境で何世代にもわたって維持される場合、ランダムな突然変異が最終的には必須の胞子形成遺伝子に影響を及ぼし、この形質の喪失につながります[53、101]。 最後に、休眠は空間的に変化する景観における生物の移動と定着を促進することによって分散と相互作用する可能性があるという証拠が増えている[102]。 ここで説明したような実験は、そのようなアイデアをテストする手段を提供するものであり、より複雑な状況における流行と病気の動態を理解するために重要となるでしょう [17]。

要約すると、休眠は生命の樹全体に広く分布する生活史戦略です。 それは、集団に構造と記憶を生成するシードバンクの生成につながる可能性があります。 その結果、種子バンクは、不利で変動する環境条件に対して個体群を緩衝する方法で、人口動態と多様性を修正します。 種子バンクは、異なる種に属する個体間の相互作用も変化させ、相利的および拮抗的な動態に影響を及ぼします。 私たちの研究は、シードバンクがファージの攻撃を受けたときに宿主集団を安定させる避難所を作り出すことができることを実証しました。 休眠によってもたらされる保護は、宿主集団の遺伝的および表現型の多様性を保持し、生態進化のフィードバックに影響を与える可能性があります。 しかし、寄生虫が、適応度の生殖または生存要素を強化する方法で細菌の休眠状態を利用できるという証拠がある[31、103、104、105]。 例えば、ファージは胞子形成遺伝子を獲得することができ、これは休眠が細菌とファージの共進化において重要な役割を果たしている可能性を示唆している[56、57]。 他の研究システムにおける同様の調査は、シードバンクが共進化プロセスにどの程度影響を与えるかを明らかにするのに役立つだろう。

配列データは NCBI SRA (BioProject PRJNA932315) で入手できます。 すべての分析を再現するためのコードとデータは、Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7786196) および GitHub (https://github.com/LennonLab) の次のリポジトリで入手できます。 、coevo-seedbank-seq、coevo-seedbank-ancestors、および Phage_spore_adsorption。

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Brent Lehmkuhl と Emily Long からの技術サポートに感謝します。 ダニエル・カーンズとフェリックス・デンプウルフがひずみを担当。 Nathan Wisnoski には、原稿の以前のバージョンに対する建設的なフィードバックをいただきました。 研究は、国立科学財団（JTL、DAS、JSW への DEB-1934554、JTL への DBI-2022049、JSW への DEB-1934586、WRS への DBI-2010885）、米国陸軍研究局助成金（W911NF-14-1-）によって支援されました。 0411、W911NF-22-1-0014、W911NF-22-S-0008 (JTL へ)) およびアメリカ航空宇宙局 (80NSSC20K0618 から JTL)。 JSW は、イル・ド・フランス地域のチェアーズ・ブレーズ・パスカル・プログラムによって部分的に支援されました。

インディアナ大学生物学部、ブルーミントン、インディアナ州、インディアナ州、米国

ダニエル・A・シュワルツ & ジェイ・T・レノン

アブドゥス サラーム国際理論物理学センター (ICTP)、トリエステ、イタリア

ウィリアム R. シューメーカー

ジョージア工科大学生物科学部、米国ジョージア州アトランタ

アンドレア・マガリエ & ジョシュア・S・ヴァイツ

ジョージア工科大学、米国ジョージア州アトランタ、定量的生物科学の学際的大学院プログラム

アンドレア・マガリエ

ジョージア工科大学物理学部、米国ジョージア州アトランタ

ジョシュア・S・ワイツ

エコールノルマル高等生物学研究所、パリ、フランス

ジョシュア・S・ワイツ

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DAS、AM、JSW、JTL が計画した研究。 DAS はデータを収集しました。 DAS、WRS、JTL 分析データ。 DAS、WRS、JTL が論文の初稿を執筆。 著者全員が原稿の編集と改訂に貢献しました。

ジェイ・T・レノンへの通信。

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転載と許可

Schwartz, DA、Shoemaker, WR、Măgălie, A. 他シードバンクを使用した細菌とファージの共進化。 ISME J (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41396-023-01449-2

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受信日: 2023 年 3 月 8 日

改訂日: 2023 年 5 月 25 日

受理日: 2023 年 5 月 30 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01449-2

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