Streptomyces lasalocidi 由来のエキノマイシン耐性付与タンパク質 Ecm16 の構造および機能解析

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7980 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

エキノマイシンは、天然物 DNA ビスインターカレーター抗生物質です。 Streptomyces lasalocidi のエキノマイシン生合成遺伝子クラスターには、自己耐性タンパク質 Ecm16 をコードする遺伝子が含まれています。ここでは、アデノシン二リン酸に結合した Ecm16 の 2.0 Å 分解能の結晶構造を示します。 Ecm16 の構造は、原核生物のヌクレオチド除去修復システムの DNA 損傷センサー構成要素である UvrA の構造によく似ていますが、Ecm16 には、UvrA に見られる UvrB 結合ドメインとそれに関連する亜鉛結合モジュールがありません。突然変異誘発研究により、Ecm16 の挿入ドメインが DNA 結合に必要であることが明らかになりました。さらに、挿入ドメインの特定のアミノ酸配列により、Ecm16 はエキノマイシン結合 DNA を正常な DNA から区別し、基質の結合を ATP 加水分解活性に結び付けることができます。異種宿主であるブレビバチルス・チョウシネンシスにおけるecm16の発現は、エキノマイシンおよび他のキノマイシン系抗生物質（チオコラリン、キナルドペプチン、サンドラマイシンなど）に対する耐性を与えた。私たちの研究は、DNA ビスインターカレーター抗生物質の生産者が、生産する有毒化合物をどのように回避するかについて新たな洞察を提供します。

キノマイシン系抗生物質は、DNA 二重らせんに非共有結合することによって作用します1。これらは、DNA ビスインターカレーターであり、DNA の隣接する塩基対の間に一対の芳香環基を挿入することによって DNA 二重鎖に可逆的に結合する化合物です。この化合物群は、その強力な抗菌作用および抗腫瘍作用により多くの関心を集めており、その結果、生化学的、構造的、および臨床的知識が膨大に蓄積されています2。しかし、DNA ビスインターカレーターに対する細菌の耐性に関する機構の詳細は依然として限られています。病原性細菌ではこれらの化合物に対する耐性要素はこれまで発見されていませんが、自然環境に存在する耐性メカニズムを特定し、解明することが賢明です。基本的な耐性メカニズムを知ることで、研究者はキノマイシン耐性が臨床上の問題になる前に新しい治療戦略を開発できるようになります。

キノマイシン抗生物質生産体には、通常、抗生物質生合成遺伝子クラスター内またはゲノム内の他の場所に存在する 1 つ以上の自己耐性遺伝子が含まれています。たとえば、トリオスチン生産菌には、ABC トランスポーターをコードする遺伝子が含まれており 3、チオコラリン生産菌には、ABC トランスポーターとチオコラリン隔離タンパク質をコードする遺伝子が含まれています 4,5。興味深いことに、キノマイシン生産菌には、UvrA の遺伝子も含まれています。生合成遺伝子クラスター内の様タンパク質 (表 1)。 UvrA は、普遍的な原核生物のヌクレオチド除去修復 (NER) 経路からの DNA 修復酵素です。簡単に説明すると、UvrA は DNA 損傷を認識し、UvrB を損傷部位にリクルートします。 UvrBは、修飾されたヌクレオチドの8ヌクレオチド上流と最大5ヌクレオチド下流のホスホジエステル結合を切断するUvrCをリクルートします。次に、UvrC は、切断された DNA 断片を置き換える UvrD ヘリカーゼをリクルートします。 DNA ポリメラーゼ I は、損傷していない相補鎖を鋳型として使用して DNA の欠損部分を合成し、DNA リガーゼが切断部分を封止して修復を完了します6。

エキノマイシンは、Streptomyces ecinatus および Streptomyces lasalocidi (以前は S. lasaliensis として知られていました) を含む複数の放線菌によって産生される典型的な DNA ビシンインターカレーターです 7,8,9。これは、2 つのキノキサリングループと珍しいチオアセタール架橋を含む環状デプシペプチドです (図 3)10。エキノマイシンは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌およびバンコマイシン耐性腸球菌に対して強力な抗菌活性を示します11,12が、溶解性と毒性の問題により臨床では使用されていません。 S. lasalocidi 由来のエキノマイシン生合成遺伝子クラスターには、キノキサリングループを合成する酵素をコードする遺伝子、ペプチド骨格を構築する酵素、および機能が未知のタンパク質をコードする遺伝子が含まれています 13。機能的に特徴付けられていないタンパク質の 1 つは Ecm16 であり、NER 経路で機能する原核生物の UvrA タンパク質と共有する配列同一性 (約 30%) に基づいて、エキノマイシンに対する自己防御機能を提供すると仮定されています 13。

我々は以前にEcm1614のインビボおよびインビトロの機能特性評価を報告しました。この研究の主な発見は、(1) エキノマイシン感受性大腸菌 K12 は、ecm16 をコードするプラスミドで形質転換するとエキノマイシン耐性になる、(2) Ecm16 はエキノマイシンを提供するために NER タンパク質 UvrA、UvrB、UvrC、または UvrD の関与を必要としない、ということです。 (3) Ecm16 は UvrA 機能を補完しない、(4) Ecm16 の ATPase 活性はその抗エキノマイシン活性に必須である、(5) Ecm16 はヌクレオチド配列に依存せずに二本鎖 DNA に結合する、(6) Ecm16 は二本鎖 DNA に結合するエキノマイシンを含む DNA に対する影響は、エキノマイシンを含まない DNA に対する影響よりも 2 倍強くなります。現在の研究では、Ecm16 の機能の構造的背景を提供するために、Ecm16 の結晶構造を決定しました。我々はまた、Ecm16 の挿入ドメインの役割を詳しく調べるために変異研究も実施しました。 UvrA タンパク質では、挿入ドメインが損傷特異的な DNA 結合に関与しています 15。最後に、本発明者らは、ecm16発現細胞を一連のキノマイシンおよび非キノマイシンDNA標的抗生物質で攻撃することにより、Ecm16の基質特異性を調べた。

我々は、アデノシン二リン酸（ADP）に結合したEcm16の構造を2.0Åの解像度で決定しました（図1a）。最終的なモデルは、Ecm16 ホモ二量体、4 つの ADP、2 つの Mg2+、4 つの Zn2+、および 612 個の水分子で構成されています (表 2)。挿入ドメイン全体を含む鎖 A の 183 ～ 293 および鎖 B の 185 ～ 295 を含む一部の残基は、電子密度が欠落しているためモデル化されませんでした (補足表 1)。 Ecm16 の各プロトマーには、ヌクレオチド結合ドメイン I および II (NBD-I および NBD-II) と呼ばれる 2 つの ABC ATPase モチーフが含まれています。 NBD-I は、ATP 結合 I ドメイン、シグネチャー I ドメイン、および挿入ドメインから構成されます。挿入ドメインは、おそらく無秩序であるため、結晶構造には見えませんでした。 NBD-II は、ATP 結合 II ドメインとシグネチャー II ドメインで構成されます。 NBD-IIには、NBD-Iの残基66〜99に対応するヘリックスターンストランドがありません（補足図1）。これら 2 つの違いを除けば、NBD-I と NBD-II は比較的類似した全体構造を持っています (208 個の Cα 原子に対して RMSD = 1.5 Å)。 Ecm16の二量体界面は約3900Å2の表面積を埋めており、ATP結合I、シグネチャーI、およびシグネチャーIIドメインの残基で構成されています（補足図2）。 Ecm16の腹側には、多数の塩基性残基（K136、K143、K381、R384、R567、K568、R537、K549、K572、K577）で裏打ちされた延長された溝が特徴です（補足図3）。この長さ約 10 nm、幅約 2 nm の溝は、約 32 bp の B 型 DNA を収容できる可能性があり、これまでに報告されている Ecm1614 の DNA 結合活性の構造的基礎を提供します。

Ecm16の結晶構造。 (a) Ecm16 ホモ二量体のドメイン組織と全体構造。挿入ドメインは一次構造には存在しますが、結晶構造には観察されません。 ADP、Zn2+、および Mg2+ 原子は球として描画されます (C: 黄色、N: 青色、O: 赤、P: オレンジ、Zn: 灰色、Mg: 緑色)。 (b) 近位ヌクレオチド結合部位。原子間の距離はÅで与えられます。 (c) 遠位ヌクレオチド結合部位。 (d) 上: 亜鉛結合モジュール 2。下: 亜鉛結合モジュール 3。(e) Streptomyces lasalocidi 由来の Ecm16 (PDB ID: 7SH1)、Bacillus stearothermophilus 由来の UvrA (PDB ID: 2R6F)、およびデイノコッカス・ラジオデュランス (PDB ID: 2VF8)。

Ecm16には、2つの近位ヌクレオチド結合部位と2つの遠位ヌクレオチド結合部位の合計4つのヌクレオチド結合部位があります（図1a）。近位ヌクレオチド結合部位は Ecm16 二量体界面から約 19 Å の位置にあり、ATP 結合ドメイン I と署名ドメイン II の間に挟まれています。遠位のヌクレオチド結合部位は二量体界面から約 26 Å の位置にあり、ATP 結合ドメイン II とシグネチャードメイン I の間に挟まれています。各 ATP 結合ドメインには、ウォーカー A モチーフ、ウォーカー B モチーフ、およびα-ヘリックスが含まれています。 ABC トランスポーター 16 および DNA 修復タンパク質 17 に通常見られる LSGGQ 配列を含む ABC シグネチャーサブドメイン。 ATP 結合ドメインと署名ドメインは Q ループによって接続されており、Q ループは主要な構造変化と他の ATPase 上の NBD のエネルギー変換ドメインの結合の部位です。近位ヌクレオチド結合部位と遠位ヌクレオチド結合部位の両方の電子密度は、ADPの存在を示しました（補足図4）。 Ecm16 に結合したヌクレオチドの正体をさらに確認するために、タンパク質抽出物の液体クロマトグラフィー分析を実行しました。この実験ではADPのみが検出されました（補足図5）。これは、Ecm16結晶構造で観察されたヌクレオチドがATPではなくADPであることを示しています。

Ecm16が10 mM MgCl2の存在下で結晶化されたにもかかわらず、Mg2+イオンは2つの近位ヌクレオチド結合部位でのみ観察され、遠位部位では観察されません（図1b、c）。この理由は明らかではありませんが、Bacillus stearothermophilus の UvrA の結晶構造についても同様の観察が行われました 19。 ADP のリン酸基は、Walker A モチーフの残基を含む広範な水素結合ネットワークに参加していますが、リボース糖とアデニン塩基は Ecm16 と比較的わずかな相互作用を形成します。 501 位の保存されたヒスチジン残基は、遠位部位の ADP のアデニン環に対してよくスタックします。各 Ecm16 プロトマーには 2 つの亜鉛結合モジュールが含まれており、これはこれまでに報告されているすべての UvrA 結晶構造で観察される UvrA 亜鉛結合モジュール 2 および 3 に対応します。モジュール2では、Zn2+はC176、C179、C296、およびC299に配位されますが、モジュール3では、Zn2+はC589、C592、C612、およびC615に配位されます（図1d）。これらの亜鉛配位残基は、UvrA および UvrA2 タンパク質に保存されています 14、15。

Ecm16の三次元構造は、B. stearothermophilusのUvrA（1002 Cα原子のRMSD = 2.6Å）およびDeinococcus radioduransのUvrA2（933のCα原子のRMSD = 1.7Å）の構造に似ています（図1e、補足図6）。。 Ecm16、UvrA、および UvrA2 の構造的類似性は、DNA 結合や ATP 加水分解などの共通の機能を説明しています 15,20。しかし、Ecm16は、UvrA2と同様に、すべてのUvrAタンパク質に見られるUvrB結合ドメインおよびそれに関連する亜鉛結合モジュール1を欠いており、これはEcm16がNER経路からUvrBと相互作用しないことを示している。これは、大腸菌 K12 の野生型と UvrB ノックアウト株の両方が、trans14 にコードされている ecm16 の発現が誘導されるとエキノマイシン耐性になったという以前の報告と一致しています。

UvrA および UvrA2 の挿入ドメインは、DNA 基質の結合に寄与すると提案されています 15、20、21。 Ecm16の挿入ドメインがDNA結合に必要かどうかをテストするために、挿入ドメインがグリシン-セリンリンカーで置き換えられたEcm16-ΔIDを調製しました（補足図7、8）。単一のエキノマイシン結合部位を含む 32 bp DNA への Ecm16 および Ecm16-ΔID の結合を監視しました (補足表 2)。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、Ecm16が通常のDNAよりもエキノマイシン結合DNAに強く結合するのに対し、Ecm16-ΔIDはどちらのタイプのDNAにも結合しないことを示しました（図2a）。次に、蛍光偏光を使用して Ecm16 と Ecm16-ΔID の DNA 結合親和性を測定しました。 Ecm16-DNA-エキノマイシンおよびEcm16-DNAの解離定数は、それぞれ11.8 nMおよび60.2 nMでした（図2b、表3）。 Ecm16-ΔID では、どちらの DNA 基質に対しても結合は観察されませんでした。したがって、EMSA と蛍光偏光は両方とも、Ecm16 の挿入ドメインが DNA 結合に必要であることを示しました。

Ecm16 の挿入ドメインはエキノマイシン耐性に必要です。 (a) 電気泳動移動度シフトアッセイを使用して分析した野生型および変異型 Ecm16 タンパク質の DNA 結合活性。反応混合物は、100、200、および300 nM Ecm16、Ecm16-ΔIDおよびEcm16*の非存在下(レーン1および2)または存在下で、DNAまたはDNA-エキノマイシン(アスタリスクでマーク)を含んでいた。元のゲルを補足図9に示します。(b) 蛍光偏光アッセイを使用して分析した野生型および変異体Ecm16タンパク質のDNA結合活性。 50 nM フルオレセイン標識 32 bp DNA (上) および 50 nM エキノマイシン DNA (下) を、タンパク質の量を増加させながらインキュベートしました。エラーバーは、3 つの独立した実験の標準偏差を表します。 (c) 1 μM DNA、DNA-エキノマイシン、DNA-フルオレセイン、および DNA-ドキソルビシンの存在下での Ecm16、Ecm16*、および UvrA の特異的 ATP 加水分解活性。エラーバーは、3 つの独立した実験の標準偏差を表します。 (d) エキノマイシン耐性の決定。 10 μM エキノマイシンの非存在下または存在下でのベクターコントロールのみ、p(VCO)、p(ecm16)、p(ecm16-ΔID)、および p(ecm16*) プラスミドを保持する大腸菌 (K12) 細胞の増殖曲線。プロットは 3 つの独立した複製を表しています。

次に、Ecm16の挿入ドメインがStreptomyces peucetius由来のEcm16ホモログであるDrrCの挿入ドメインと交換されたEcm16*を調製しました（補足図7、8）。 DrrC の分子機構は不明ですが、DrrC は DNA モノインターカレーター抗生物質であるダウノルビシンに対する耐性を与えることが報告されています 22。 Ecm16 と DrrC の挿入ドメインは 32% のアミノ酸配列同一性を共有します。 Ecm16*は、通常のDNAよりも2.4倍強くエキノマイシン含有DNAに結合しました(KD = 37.7 nM対90.8 nM)(図2b、表3)。この結果は、Ecm16 が異なる結合を通じてエキノマイシン結合 DNA を正常 DNA から区別するには、相同挿入ドメインを有するだけで十分であることを示しています。 Ecm16* が抗エキノマイシン活性を持つかどうかを調べるために、Ecm16* を発現する大腸菌 K12 細胞を 10 μM エキノマイシンでチャレンジしました。 Ecm16 * 発現細胞はエキノマイシンに対して感受性があり(図2d)、抗エキノマイシン活性を提供するには天然の挿入ドメインが存在する必要があることを示しています。

我々は以前、Ecm16 の ATP 加水分解活性が in vivo でエキノマイシン耐性を与えるために必要であることを報告しました 14。 Ecm16* はエキノマイシン含有 DNA に優先的に結合したが、エキノマイシン耐性を付与できなかったため、Ecm16* は ATP を加水分解できないと予測した。この考えをテストするために、薬物を含まない DNA、エキノマイシン結合 DNA、フルオレセイン修飾 DNA、およびドキソルビシン結合 DNA の存在下で Ecm16、Ecm16-ΔID、Ecm16*、および UvrA の ATP 加水分解活性を測定しました (補足表) 2)。エキノマイシン結合 DNA は Ecm16 の天然基質と推定され、フルオレセイン修飾 DNA は UV 損傷 DNA を模倣し、UvrA の既知の基質ですが Ecm1614,20 ではなく、ドキソルビシン結合 DNA は DrrC23 の基質と推定されます。 Ecm16のATP加水分解活性は、エキノマイシン結合DNAの存在下で16倍増加しましたが、我々がテストした他のDNA基質では増加しませんでした（図2c）。 Ecm16* および UvrA は、4 つの DNA 基質すべてに対して同様の基礎 ATPase 活性を示しました。 Ecm16-ΔIDは、すべてのDNA基質に対して有意なATP加水分解活性を示さなかった（補足図10）。これは、Ecm16ΔIDがDNAに結合できないことと一致する（図2a、b）。これらの結果は、天然の DNA 基質のみが Ecm16 の ATP 加水分解活性を刺激し、挿入ドメインが欠失するか相同タンパク質の挿入ドメインで置換されるとこの特性が失われることを示しています。したがって、挿入ドメインは、Ecm16 の基質特異性の決定および Ecm16 の抗エキノマイシン活性のサポートにおいて重要な役割を果たします。

われわれは、Ecm16が他のDNA結合薬物分子（ドキソルビシン、マイトマイシンC、ダウノルビシン、アクチノマイシンD、シスプラチン、チオコラリン、キナルドペプチン、サンドラマイシン）に対する耐性を提供できるかどうかを試験することによって、Ecm16の基質特異性を調べた。これらの化合物の透過性はグラム陰性 (二胚葉) 細菌では制限されているため、大腸菌 K12 の代わりにグラム陽性 (単胚葉) 細菌 Brevibacillus choshinensis を使用しました。 Ecm16を発現するB. choshinensis細胞は、DNAビスインターカレーター抗生物質であるエキノマイシン、チオコラリン、キナルドペプチン、およびサンドラマイシンに対してのみ耐性を示しました（図3）。 Ecm16 によってもたらされる耐性の程度は、試験した最高の抗生物質濃度で最も顕著でした。コントロールベクターを含む細胞は、0.1 μM エキノマイシン、4 μM チオコラリン、6 μM キナルドペプチン、または 2 μM サンドラマイシンの存在下では増殖が非常に遅く、倍加時間を決定することができませんでしたが、Ecm16 を発現する細胞は細胞とより類似した倍加時間を示しました。これらはそれぞれの抗生物質で処理されませんでした（1.1～1.2倍だけ長くなりました）（図3）。我々の結果は、Ecm16 がエキノマイシンに対して最も効果的であるが、構造的に類似した他のキノマイシン系抗生物質に対してもある程度の耐性を与えることを示しました。

pNI ベクターコントロールのみ (VCO) または ecm16_pNI プラスミドを使用した B. choshinensis 株の増殖曲線の研究。細胞は、50μg/mlのネオマイシン抗生物質を補充した2SY培地中で増殖させた。 B. choshinensis 株を、指定濃度のエキノマイシン (0.025、0.05、0.1 μM)、チオコラリン (0.5、2.0、4.0 μM)、キナルドペプチン (1.5、3.0、6.0 μM) およびサンドラマイシン (0.5、1.0、2.0 μM) DNA とともにインキュベートしました。ビスインターカレーター。エラーバーは、3 つの独立した実験の標準偏差を表します。

今回我々は、エキノマイシン生産者であるS. lasalocidi由来のEcm16の結晶構造を報告する。 Ecm16 は、原核生物の NER 経路からの DNA 損傷センサータンパク質である UvrA のホモログです。 Ecm16 と UvrA の主な構造の違いは、Ecm16 には、これまでに報告されているすべての UvrA 構造に存在する UvrB 結合ドメインと亜鉛結合モジュールが欠如していることです (PDB ID: 2R6F、3PIH、3UWX、3UX8、3ZQJ、6N9L)。もう 1 つの潜在的な構造的違いは、約 100 残基の挿入ドメインの立体構造ですが、挿入ドメインは Ecm16 結晶構造では見えず、おそらくこのドメインは結合した DNA 基質の非存在下で可動性であるため、これについてはまだ検証されていません。全体として、Ecm16 と UvrA の三次元構造は非常に類似しています。これらは同じタンパク質の折り畳みを共有しており、両方とも 4 つの ATP 結合部位と 1 つの連続した DNA 結合溝を含んでいます。したがって、Ecm16 と UvrA は両方とも ATPase 活性を示し、二本鎖 DNA14 に結合します。しかし、Ecm16 には UvrB 結合ドメインとそれに関連する亜鉛結合モジュールが欠如しており、Ecm16 と UvrA が潜在的に分岐進化を通じて獲得された異なる分子機構を持っていることが示唆されています。

Ecm16ΔIDは挿入ドメインを欠いているため、DNAに結合できませんでした。さらに、大腸菌 K12 における Ecm16ΔID の発現は細胞をエキノマイシンから保護しませんでした。ダウノルビシン耐性タンパク質DrrCの挿入ドメインを有するEcm16*は、エキノマイシン結合DNAに対して通常のDNAより2.4倍高い結合親和性を示しました。しかしながら、Ecm16 * は、Ecm16とは対照的に、エキノマイシン含有DNAの存在下でATP加水分解速度の劇的な増加を示さなかった。これらの結果に基づいて、Ecm16 によるエキノマイシン結合 DNA の検出のための 2 段階モデルを提案します。最初のステップでは、Ecm16 は異なる DNA 結合親和性によってエキノマイシン結合 DNA を正常 DNA から識別します。この最初のスクリーニングステップでは、配列に依存しない挿入ドメインの存在が必要です。第 2 ステップでは、Ecm16 に結合した DNA 基質が、Ecm16 の ATPase 活性を刺激する能力によってさらに識別されます。この 2 番目のステップには、エキノマイシンに特異的に一致する挿入ドメインが必要であると思われます。これら 2 つのステップが分子レベルでどのように達成されるかを決定するには、追加の構造研究が必要です。特に、エキノマイシン結合 DNA およびエキノマイシン非含有 DNA と複合体を形成した Ecm16 の原子構造は、分子機構の解読に役立ちます。興味深いことに、Ecm16 は天然産物 DNA ビスインターカレーターであるチオコラリン、キナルドペプチン、サンドラマイシンに対する保護も提供しました。これは、さまざまな DNA 損傷を検出する UvrA タンパク質の能力を思い出させます。

抗生物質耐性のメカニズムを理解することは、新しい治療戦略の開発を可能にするため重要です。私たちの研究は、潜在的に新規な抗生物質耐性メカニズムを解明し始めていますが、Ecm16 がどのようにしてエキノマイシン耐性を与えるのかを完全に理解するにはさらなる研究が必要です。これには、さまざまな DNA 基質に結合した Ecm16 の構造を決定し、Ecm16 のパートナータンパク質が存在する場合にはそれを同定することが含まれます。 Ecm16 がパートナータンパク質を必要とすると仮定すると、Ecm16 は 3 つの遠縁の生物、S. lasalocidi、E. coli、および B. choshinensis で発現するとエキノマイシン耐性を与えるため、それらのタンパク質は異なる系統系統を通じて保存されている可能性があります。

この研究で使用した株とプラスミドを表S4に示します。大腸菌 DH5α (Invitrogen) 株をクローニング、プラスミド増殖に使用し、増殖曲線の研究は大腸菌 (K12) (Invitrogen) 株を使用して実施しました。適切な抗生物質を含む Luria-Bertani (LB) ブロス (Difco) を使用して、37 °C で一定の通気と 200 rpm での振盪を行いながら大腸菌培養物を増殖させました。固体培地で培養した大腸菌株を LB 寒天 (Fisher BioReagents) 上にプレーティングし、37 °C でインキュベートしました。 LB増殖培養物における遺伝子発現の誘導のために、0.2%のl-アラビノース(Alfa Aesar)を添加した。 B. choshinensis 株（タカラバイオ）を MT（10 mg ml-1 グルコース、10 mg ml-1 フィトンペプトン、35% エーリッヒカツオエキス、2 mg ml-1 酵母エキス青ラベル、10 μg ml-1 FeSO4）中で増殖させました。、10 μg ml-1 MnSO4、1 μg ml-1 ZnSO4、4.1 μg ml-1 MgCl2) 培地。増殖曲線研究のために、B. choshinensis 株を 2SY (20 mg ml-1 グルコース、40 mg ml-1 バクトソイトン、5 mg ml-1 バクト酵母エキス、150 μg ml-1 CaCl2) 液体培地で 37°で培養しました。２００ｒｐｍで振盪しながらＣ．異なるプラスミドを保有する大腸菌およびB. choshinensis細胞を、アンピシリン（大腸菌については50μg ml-1の液体培地および100μg ml-1の固体培地）およびネオマイシン（B. choshinensisについては50μg ml-1）の存在下で維持した。）。 B. choshinensis 株は、-80 °C で保存培養物として維持されました。保存培養物は、40% グリセロールを含む LB 培地中で凍結されました。

ecm16およびecm16-ΔIDのコドン最適化遺伝子を、大腸菌での発現のためにNdeIおよびEcoRI部位(GenScript)を使用してpUC19ベクターにサブクローニングした。酵素NdeIおよびEcoRIを使用して遺伝子を消化し、ゲル精製した。ｐＥＴ２８ａ（＋）発現ベクターをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ゲル精製した。 ecm16およびecm16-ΔIDインサートを、クイックライゲーションキット(New England Biolabs Inc)を使用して、3:1のインサート:ベクター比でpET28a(+)ベクターにライゲーションした。ライゲーション産物を化学的にコンピテントな大腸菌 DH5α 細胞に形質転換し、LB-kan プレート (50 μg ml-1) 上で 37 °C で一晩増殖させました。 coli BL21 (DE3) (Novagen) 細胞を発現ベクターで形質転換し、 50 μg/ml カナマイシンを含むルリアベルターニ (LB) 培地中で 37 °C で対数期。 Ecm16*を、それぞれ5'および3'部位でEcoR1およびHindII制限消化酵素を使用する同じ手順を使用して、pET28a(+)ベクターにクローン化した。 ecm16 の発現は、0.25 mM イソプロピル-d-1-チオガラクトピラノシド (Thermo Scientific) を使用し、OD600 での光学密度 0.6 ～ 0.8 で誘導されました。細胞をさらに 18 °C で 16 時間増殖させた後、4 °C、6000 × g で 15 分間遠心分離して回収しました。細胞ペレットを溶解バッファー (50 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl、10 mM イミダゾール、および 5% グリセロール (v/v)、1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド、10 μg/ml DNase、および 10 mM MgCl2) に再懸濁し、次の方法で溶解しました。超音波処理。細胞溶解物を 30,000 × g、4 °C で 60 分間遠心分離し、不溶性物質を除去しました。可溶性画分を結合緩衝液（50 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl）で平衡化した5 ml Ni-NTAカラム（GE Healthcare）にロードし、250 mlの洗浄緩衝液（50 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl）で洗浄しました。、３０ｍＭイミダゾール、および５％（ｖ／ｖ）グリセロール）、結合タンパク質を溶出緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２００ｍＭＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）で溶出した。溶出したタンパク質溶液を 5 mL HiTrap QHP HP カラム (GE Healthcare) にアプライし、結合タンパク質を 50 ～ 500 mM NaCl の直線勾配を使用して溶出しました。最後に、Ecm16サンプルを、Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare)を使用して、50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl中でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質の純度はSDS-PAGEによって分析されました。タンパク質サンプルは、Amicon 10-kDa MWCO 遠心フィルターを使用して濃縮されました。すべての精製ステップは 4 °C で実行されました。 Ecm16-ΔIDおよびEcm16*変異体は、野生型Ecm16タンパク質と同じ方法で調製した。

大腸菌を使用したインビボ研究では、以前に構築したpET28aベクターからのコドン最適化ecm16およびecm16-ΔIDを、Phusionポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用してSacIおよびEcoRI部位とともに増幅した。遺伝子を0.7%アガロースゲル上で電気泳動的に分離し、ゲル精製した。精製後、遺伝子をSacIおよびEcoRI(New England Biolabs)で消化し、同様に消化したpBAD-Myc-HisAベクター(Thermo Fisher)にクローン化した。消化後、ベクターをエビアルカリホスファターゼ(New England Biolabs)で処理した。消化されたベクターと消化された断片の両方を 0.7% アガロースゲルで電気泳動的に分離し、ゲルを再度精製しました。T4 DNA リガーゼ (New England Biolabs) を使用して断片を pBAD ベクターにライゲーションし、エレクトロコンピテント DH-5α 細胞に形質転換し、一晩増殖させました。 LB-amp プレート (100 μg ml-1) 上、37 ℃、大腸菌 BW25113 (Coli Genetic Stock Center) 細胞を発現ベクターで形質転換し、50 μg/ml アンピシリンを含む LB 培地で 37 ℃ で対数増殖期まで培養しました。。 ecm16*を有するBW25113細胞の構築は、制限消化にHindIIIおよびEcoRI部位を使用したことを除いて、BW25113-ecm16およびBW25113-ecm16-ΔIDと同様に実施した。

Thermotoga maritima 由来の UvrA 遺伝子を pET28a (+) ベクターにコードし、大腸菌 Rosetta (DE3) pLysS 細胞に形質転換しました。 50 μM イソプロピル-β-d-ガラクトシド (IPTG) を使用してタンパク質発現を誘導し、30 °C で 5 時間インキュベートしました。細菌細胞を、50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、2 mM ジチオスレイトール (DTT)、1 mM フッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF) および 5% (v/v) グリセロールを含む緩衝液に再懸濁し、超音波処理しました。溶解物を１８，０００ｒｐｍで４５分間遠心分離し、上清をＨｉｓ－Ｔｒａｐ粗製５ｍｌカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。 UvrAは、200 mlのイミダゾール濃度0から500 mMの勾配で溶出されました。精製タンパク質を、50 mM Tris pH 8.0、2 mM DTT、および5% (v/v) グリセロールを含む緩衝液で希釈し、5 mL HiTrap Q HP カラム(GE Healthcare)にアプライした。ＵｖｒＡを、５０ｍＭから１Ｍまでの５０ｍＬのＮａＣｌ直線勾配で溶出した。タンパク質を、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、２００ｍＭＮａＣｌ、 2 mM DTT および 5% (v/v) グリセロール。収集したタンパク質サンプルの体積を最終濃度 10 mg/ml まで減らし、液体窒素中で急速冷凍しました。

Ecm16 結晶は、1 μl のタンパク質溶液 (8 mg ml-1 Ecm16、10 mM MgCl2、1 mM ADP) と 1 μl の平衡化緩衝液 (0.1 M MES pH) を混合するハンギングドロップ法を使用した蒸気拡散によって 18 °C で成長させました。 6.5、0.2 M チオシアン酸ナトリウムおよび 12% PEG (w/v) 20 K)。結晶を、急速冷凍する前に、20% v/v エチレングリコールを含む同じ緩衝液に移した。

最初の X 線回折実験はスタンフォードシンクロトロン放射光源で行われました。最終的な X 線回折データセットは、アルゴンヌ国立研究所の高度光子源のビームライン 17-ID-B で収集され、autoPROC24 を使用して処理されました。探索モデルとしてPHASER25とUvrA2構造(PDB:2VF7)15を用いて分子置換を行った。 PHENIX26 と REFMAC27 を使用して構造精密化を実行しました。モデルの構築は COOT28 を使用して行われ、代わりに PHENIX26 を使用した改良セッションが行われました。

B. choshinensis での発現のためにコドン最適化された ecm16 遺伝子を合成し (GenScript)、BamHI および XbaI 部位を使用して pUC19 ベクターに挿入しました。 B. choshinensis と E. coli 間のシャトルベクター pNI はタカラバイオから購入しました。 pNI ベクターは、B. choshinensis で強く発現される細胞壁タンパク質の 5' 配列上流の一部である P2 プロモーターの下にあります。 ecm16は、上記のライゲーションプロトコールに従ってpNIベクターに挿入されました。ライゲーション産物を化学的にコンピテントな大腸菌 DH5α 細胞に形質転換し、LB-amp (50 μg ml-1) プレート上で 37 °C で一晩増殖させました。 ecm16_pNI クローンは、BamHI および XbaI を使用して制限酵素消化を実行することによって確認されました。プラスミド ecm16_pNI または pNI を、製造業者のガイドライン (タカラバイオ) 29 に従って New Tris-PEG (NTP) 法を使用して B. choshinensis に形質転換しました。簡単に説明すると、溶液 A (Takara Bio) と混合した 100 ng のプラスミドをコンピテント B. choshinensis 細胞ペレットに添加し、室温で 5 分間インキュベートしました。次に、PEG含有溶液Bを加え、ボルテックスし、遠心分離した。細胞ペレットをMT培地に再懸濁し、37℃で3時間インキュベートしました。次に細胞をネオマイシン (50 μg ml-1) を含む MT 寒天プレートに播種し、37 °C で一晩培養しました。 4 ～ 5 個のコロニーを 3 ml の 2SYNm 液体培地に接種し、120 rpm で軌道振盪しながら 30 °C で 48 時間増殖させました。細胞を遠心分離し、細胞ペレットを１×リン酸塩（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）緩衝液に再懸濁した。 B. choshinensis における Ecm16 の発現は、SDS-PAGE 分析によって確認されました。

908 μM エキノマイシン (MilliporeSigma) および 864 μM チオコラリン (Cayman Chemical) のストック溶液をメタノールで調製しました。 805 μM キナルドペプチン (Cayman Chemical) および 819 μM サンドラマイシン (Cayman Chemical) ストック溶液を DMSO で調製しました。増殖曲線と生化学的研究では、すべての化合物を H2O を使用して希釈しました。大腸菌増殖曲線実験では、培養物を 30 μg ml-1 アンピシリンを補充した LB 液体培地中で 37 °C、200 rpm で一晩増殖させました。飽和培養物を０．２％アラビノース溶液で３０分間誘導し、これを使用して、１３ｍｍガラス管中の０．０２ＯＤ６００で２ｍＬの複製サンプルを接種した。 OD600 測定値を 30 分ごとに 6 時間測定しました。 2SYNm 培地における B. choshinensis の増殖プロファイリングでは、マルチウェルプレートリーダー (Synergy HT、BioTek) を使用して OD600 を測定しました。通常、OD600 が 1.0 ～ 1.2 の一晩培養液 3 μl を使用して、新鮮な 2SYNm 培地 200 μl を含むウェルに接種し、96 ウェルプレートで 30 分ごとに 10 時間増殖をモニターしました。

ＰＡＧＥ精製した３２ｂｐのＤＮＡ基質（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をアニーリング緩衝液（３０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ酢酸カリウム）に溶解した。この DNA には 5' ACGT 3' エキノマイシン結合部位が含まれていました (表 S2)。エキノマイシン-DNA複合体は、エキノマイシンとDNAをモル比1.1:1でインキュベートすることによって形成されました。異なる濃度の精製Ecm16、Ecm16-ΔID、Ecm16* (0、100、200、および300 nM)を、50 nM DNAとインキュベートしました。結合緩衝液（50 mM HEPES、pH 7.5、50 mM NaCl、0.1 mg ml-1 ウシ血清アルブミン）中のエキノマイシンの存在または非存在を室温で15分間測定した。反応混合物を、ランニングバッファーとして1×TBE (40 mM 酢酸トリス、0.5 mM EDTA) を使用し、4℃で6% 天然ポリアクリルアミドゲル中で40 mAで30分間分離した。ゲルは、1×TBE緩衝液中の1×SYBR金核酸染色液を使用して染色し、紫外線トランスイルミネーター(Azure c200)を使用して画像化した。

フルオレセイン標識された32 bp DNA オリゴヌクレオチド (Integrated DNA Technologies) を結合緩衝液 (50 mM HEPES、pH 7.5、50 mM NaCl) に溶解し、最終濃度 50 nM で反応ウェルに等分しました。エキノマイシンの存在下または非存在下で精製したEcm16またはEcm16-ΔIDまたはEcm16*を結合緩衝液で段階希釈し、4〜512nMの範囲の濃度で最終容量100μlになるまで各反応ウェルに添加した。 FAM 標識 DNA の偏光の変化を検出するために、Synergy HT (BioTek) プレートリーダーを使用し、励起波長と発光波長が 490 の黒色低容量プレート (Corning) 上の 384 ウェル形式で蛍光測定を実行しました。それぞれnmと520nm。報告された偏光値は 3 回の独立した実験の平均です。データは、Hill 方程式を使用して Graph Pad Prism 5 で分析されました。計算された解離定数 (KD) を表 3 に示します。

精製タンパク質の ATPase 活性は、EnzChek™ リン酸アッセイキット (Thermo Fisher) を使用して測定しました。このアッセイでは、ATP の加水分解で生成される無機リン酸がプリンヌクレオシドホスホリラーゼ (PNP) によって利用され、2-アミノ-6-メルカプト-7-メチルプリン (MESG) がリボース 1-リン酸と 2-アミノ-6-メルカプト-7 に変換されます。 -メチルプリン。生成物の形成は、360 nm での吸光度を測定することによって追跡されます。 ATPase アッセイの前に、エキノマイシンを 32 bp DNA とモル比 1.1:1 で室温で 15 分間インキュベートしました。精製 Ecm16 (0.2 μM) を、反応バッファー (50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、10μM) 中でさまざまな ATP 濃度 (0.125、0.325、0.75、1.0、1.5 および 2.0 μM) の 1 μM DNA またはエキノマイシン-DNA 複合体とインキュベートしました。 mM MgCl2)。 MESG (200 μM) 基質および PNP (500 μM) 酵素を添加し、22 °C でマイクロプレートリーダー (Synergy HT、BioTek) を使用して 360 nm での UV 吸光度を 30 秒ごとに測定しました。 360 nm での光学密度を分解された ATP の量に変換するために、リン酸塩標準を使用して OD360nm をプロットすることによって検量線を作成しました。

Ecm16 座標と構造因子は、アクセッションコード 7SH1 でタンパク質データバンクに寄託されています。

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Thermotoga maritima UvrA の発現プラスミドを提供してくださった Marcin Nowotny 博士に感謝します。 X 線回折データは、Advanced Photon Source と Stanford Synchrotron Radiation Lightsource で収集されました。 Advanced Photon Source は、契約番号 DE-AC02-06CH11357 に基づいてアルゴンヌ国立研究所によって DOE 科学局のために運営されている DOE 科学局のユーザー施設です。 SLAC 国立加速器研究所のスタンフォードシンクロトロン放射光源の使用は、契約番号 DE-AC02-76SF00515 に基づいて、米国エネルギー省科学局基礎エネルギー科学局によってサポートされています。 SSRL 構造分子生物学プログラムは、DOE 生物環境研究局、および国立衛生研究所、国立総合医科学研究所 (P41GM103393 を含む) によって支援されています。この研究は、テキサス大学システムスター賞 (C.-YK)、中国陝西省国際協力プロジェクト 2023-GHYB-08 (XC)、州主要腫瘍生物学研究所のオープンプロジェクトプログラム CBSKL2022KF13 (XC) によって支援されました。）。

キム・チュヨン

現在の住所: 米国イリノイ州アーバナ、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校分子細胞生物学部生化学教室

テキサス大学エルパソ校化学生化学学部（米国テキサス州エルパソ）

プリヤンカ・ゲイド、アンワル・ウラー、キム・チューヨン

イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校、分子細胞生物学部微生物学科、米国イリノイ州アーバナ

アマンダ・アーランドソン & パオラ・E・メラ

教育省の合成および天然機能分子の主要研究室、西北大学化学材料科学院、西安、710127、中国

シー・チェン

スタンフォードシンクロトロン放射光源、SLAC国立加速器研究所、メンローパーク、カリフォルニア州、米国

イリンパン I. マシューズ

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PG、AU、XC、IIM、および C.-YK は、X 線結晶構造解析実験を実施しました。 PG、AE、PEM、および C.-YK は生化学および細胞の研究を実施しました。 PEM と C.-YK は研究を設計、監督し、データを分析しました。 PG と C.-YK は、すべての著者からの意見をもとに原稿を書きました。

パオラ・E・メラまたはキム・チューヨンとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Gade, P.、Erlandson, A.、Ullah, A. 他 Streptomyces lasalocidi 由来のエキノマイシン耐性付与タンパク質 Ecm16 の構造および機能解析。 Sci Rep 13、7980 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34437-9

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受信日: 2022 年 9 月 14 日

受理日: 2023 年 4 月 29 日

公開日: 2023 年 5 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34437-9

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