植物のスクローストランスポーターSUC1の構造とスクロース結合機構

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メトリクスの詳細

光合成組織から師部へのスクロースの輸入は、低親和性スクローストランスポーターファミリー (SUC/SUT ファミリー) のトランスポーターによって媒介されます。さらに、他の組織へのスクロースの再分布は、この輸入活動によって生じる高い膨圧の産物である師部液の動きによって引き起こされます。さらに、高濃度の糖を蓄積する果物、シリアル、種子などのシンク器官も、このスクロースの能動輸送に依存しています。今回我々は、スクロースとプロトンの共輸送体であるシロイヌナズナSUC1の外側に開いた立体配座の構造を2.7Åの分解能で、分子動力学シミュレーションと生化学的特性評価とともに提示する。私たちは、プロトン駆動によるショ糖の取り込みに必要な重要な酸性残基を特定し、プロトン化とショ糖結合がどのように強く結びついているかを説明します。スクロースの結合は 2 段階のプロセスであり、最初の認識は、厳密な pH 依存性の方法で主要な酸性残基に直接結合するグルコシル部分によって媒介されます。私たちの結果は、植物において低親和性のショ糖輸送がどのように達成されるかを説明し、選択性の定義に役立つさまざまな SUC 結合剤を正確に特定します。我々のデータは、陽イオン駆動シンポートへのリンクを伴うプロトン駆動シンポートの新しいモードを実証し、高濃度の基質環境における一般的な低親和性輸送の広範なモデルを提供します。

スクロースは植物の成長と発育に不可欠であり、植物の中心的な代謝産物として機能し、さらにシグナル伝達分子としての役割も担っています1、2、3。ほとんどの植物種では、スクロースが光合成中に生成される同化炭素の主な形態です。緑色のソース組織（通常は葉）からエネルギーを必要とするシンク組織までの長距離のスクロース分布は、師管4によって媒介されます。ここでは、スクローストランスポーターファミリー（SUT/SUCファミリーと呼ばれる）とSWEETファミリーの2つのファミリーの糖トランスポーターが中心的な役割を果たしています5、6、7、8。 SWEET促進因子が糖を排出するのに対し、能動的な負荷は原形質膜プロトンの推進力を利用してショ糖の取り込みを促進して蓄積させるSUCに依存しており、その濃度は師管内で1.3モルにも達します9、10、11、12、13、14。師部樹液の動きは、この SUC 活動によって生成される高い膨圧の産物です 6,15。さらに、発生段階で高濃度の糖を蓄積する果物や種子などのシンク器官も、SUC によるスクロースの能動輸送に依存しています 15,16。

SUC は、メジャーファシリテータースーパーファミリー (MFS) に属するグリコシド-ペントシド-ヘキスロニド (GPH): カチオン共輸送体ファミリーの一部です 17,18。 GPH ファミリーのメンバーは、グルコース、メリビオース、スクロースなどの小さな可溶性分子から、通常は一価カチオンの輸送と共役している大きな両親媒性リゾ脂質に至るまで、広範囲の基質を輸送することが知られています 19、20、21。 SUC はプロトン共役トランスポーターであるため、多様な GPH ファミリーの中で独自の位置を占めており、他の既知の分枝との配列同一性は非常に低い (<16%)。

SUC は植物生理学の基本的なプロセスにおいて重要な役割を果たしているにもかかわらず、その作用メカニズムは依然として不明です。 SUCがどのようにしてスクロースを認識するのか、また輸送がどのようにプロトンと結合するのかは不明である。ショ糖濃度が極めて高い環境にショ糖を放出する能力を有するショ糖結合部位は、独特の特徴を持っているに違いありません。実際、駆動陽子勾配との結合は緊密でよく調整されていなければなりません。シロイヌナズナには 9 つの SUC トランスポーター (SUC1 ～ 9) があり、SUC1 は最初に同定されたショ糖 – H+ 共輸送体の 1 つです (拡張データ図 1)22,23,24,25,26,27,28。 SUC1 は主に生殖器官、毛状突起および根で発現され、細胞膜に局在し、適切な花粉機能に必要です 24、29、30、31、32、33。

ここでは、包括的な生化学的特性評価および分子動力学 (MD) シミュレーションとともに、A. thaliana SUC1 の構造を紹介します。私たちの研究は、基質認識と、プロトンがどのようにして独特の機構でショ糖輸送に直接結合するかを説明することにより、プロトン共役ショ糖輸送を理解するための鍵となる要素を正確に特定します。この機構により、スクロースモル濃度が高い環境でのスクロースの結合と放出が可能になります。これは、師部の適切な機能、アポプラスティックに分離された組織への輸送、および植物の成長にとって不可欠です。

SUCの輸送機構を調べるために、さまざまなSUCトランスポーターをスクリーニングし、A. thaliana SUC1がSaccharomyces cerevisiaeで安定してよく発現していることを確認しました（拡張データ図2a-d）。卵母細胞取り込みアッセイでは、SUC1 は 1.28 mM の見かけのミカエリス定数 (Kmapp) で強力なスクロースの取り込みを示し (図 1a および拡張データ図 3a)、以前の結果と同等です 6,34。精製された SUC1 タンパク質はリポソームに再構成され、固体支持膜 (SSM) 電気生理学による容量結合を使用して輸送が測定されました。これは、pH 5.5で19 mMのKmapp（メソッドのSSMベースの電気生理学アッセイ）で、in vitroでのスクロースに対する同様の強力ではあるが低い親和性を示しました（図1b）。我々は、インビボではプロトン濃度の増加によって輸送が刺激され、インビトロでは対称的なpH 5.5で機能的に最適な機能を有する、強いpH依存性を発見しました（拡張データ図3b、c）。

a、ミカエリス・メンテン非線形フィットを用いた、pH 5.5でのSUC1の卵母細胞取り込みアッセイ。データポイントは平均±標準偏差です。点は生物学的に独立した測定値を表します (濃度 0.8、1.5、6、および 15 mM の場合は n = 4、濃度 20 mM の場合は n = 6、濃度 0.1 および 0.3 mM の場合は n = 9)。 b、対称pH 5.5でのSUC1プロテオリポソームに対するSSMベースの電気生理学によって決定されたピーク電流。輸送はミカエリス・メンテン反応速度論によって説明できます。データポイントは平均値±標準偏差（n = 3 の生物学的独立実験）です。挿入図は、さまざまなスクロース濃度での生の電流トレースを示しています。 c、SUC1 の 2.7 Å 電子密度マップ (1σ で等高線化された 2mFo-DFc マップ)。 N および C ドメインに対応する濃度は、それぞれシアンとオレンジに色付けされます。 EHR および IHR ドメインは淡黄色で色付けされています。 d、ドメインに従って色分けされた、原形質膜の平面におけるSUC1の構造の側面図。下は、細胞外側から見た上面図で、M1 ～ M12 が標識されています。 EHR-M6 接続ジスルフィド橋が示されています。 e、SUC1のトポロジ。乱れた N 末端 (残基 1 ～ 24) および C 末端 (残基 501 ～ 513) の端はダッシュで示されています。

ソースデータ

我々は、解像度 2.7 Å の結晶学を使用して SUC1 の構造の解明を進めました（図 1c および拡張データ図 2a ～ d）。非対称ユニットでは、SUC1 は非生理学的逆二量体を形成し、両方の単量体が同じ立体構造をとります (Cɑ 原子の二乗平均平方根偏差 (rmsd) = 0.1 Å)。優れたマップ密度により、29.3％の遊離R因子（Rfree）を持つ残基25〜500（513残基中）を含む最終的な原子モデルの構築が可能になりました（図1c、拡張データ図4、および補足表1）。全体として、SUC1 は、12 の膜貫通ヘリックスが 2 つの 6 ヘリックスドメイン、N 末端ドメイン (N ドメイン、M1 ～ M6) と C 末端ドメイン (C ドメイン、M7 ～) からなる 2 つの偽対称の半分に配置された標準的な MFS トランスポーターの折り畳みを採用しています。 M12) (図 1d、e)。 2 つのドメインは、実験マップで明確に定義されている 26 残基の短い細胞質リンカー領域によって接続されています。注目すべきことに、細胞質リンカーには9残基の両親媒性αヘリックス（細胞内ヘリックス領域（IHR）と呼ばれる）が含まれています（図1c〜eおよび拡張データ図4および5a、b）。細胞外には、M5 と M6 の間のループ接続に短いヘリックス領域 (細胞外ヘリックス領域 (EHR) と呼ばれる) が存在し、これも明らかな両親媒性特性を持っています。 EHRは、厳密に保存された残基Cys216とCys220の間のジスルフィド架橋によってNドメインの側面に固定されています（図1dおよび拡張データ図4、5a、c、および6）。我々は、突然変異誘発によるIHRとEHRの役割を調査し、卵母細胞の輸送活性はIHRの疎水性残基の突然変異誘発とは無関係であるように見えることを発見した（拡張データ図5b、d）。しかし、細胞外側の EHR は変化に非常に敏感です。ジスルフィド橋の Cys216 を変異させて短い EHR-M6 リンクを破壊すると、輸送が失われます。膜リーフレットに埋もれているように見える EHR の 3 つの残基 (Leu204、Met207、および Phe208) を極性セリン残基に変異させると、同様に輸送が失われ、この細胞外領域の輸送中に重要な役割を果たしていることが示唆されます (拡張データ図 1)。 5e)。

この構造は、サイトゾル側のNドメインとCドメインの間に保存された静電ネットワークを備えた外側に開いた構造でSUC1を捕捉します（拡張データ図6および7）。 N ドメインと C ドメインの間の膜面の約 3 分の 2 にまたがる、大きく明確に定義された V 字型の空洞が細胞外側に開いています (図 2a)。全体的に、キャビティは電気陰性ですが、周囲の底に向かうにつれて電気陽性になります。結晶化中にスクロースが存在するにもかかわらず、キャビティ内ではスクロース結合の定義された密度は観察されません。

a、膜面（左）または細胞外側（右）から見た外側に開いた立体構造を示すSUC1のスラブ図。破線のボックスは、H+結合部位およびスクロース結合ポケットの領域を指します。表面は静電位 (kBT e−1) によって色付けされます。 b、aに示すプロトン結合部位の拡大図。プロトン部位を構成する残基ペア（Asp152（赤）とGln50（青））間の距離は破線の矢印で示されており、8.2Åが最短距離（Asp152ε-酸素からGln50ε-酸素/窒素まで）である。 c、3つの異なる外部pH値でのプロトン部位ポケットを標的とするSUC1変異体の卵母細胞取り込みアッセイ。ボックスは 25 パーセンタイルから 75 パーセンタイルまで広がり、中央値が表示されます。ひげは最小値と最大値まで伸びます。点は生物学的に独立した実験を表します (S78A (pH 3.5 および 5.5) および Q456A (pH 3.5) では n = 4、WT (pH 4.5)、水 (pH 3.5、4.5 および 5.5)、C74A (pH 5.5) では n = 5、 S78A (pH 4.5)、および Q456A (pH 4.5); WT (pH 3.5 および 5.5)、W47A (pH 3.5、4.5 および 5.5)、Q50A (pH 3.5、4.5 および 5.5)、C74A (pH 3.5) の場合は n = 6および4.5）、D152N（pH 3.5、4.5および5.5）およびQ456A（pH 5.5））。色はパネル b の残基に対応します。 d、30 mM スクロースの添加によって誘発された WT SUC1 (淡い緑色から濃い緑色)、SUC1-D152N (淡い赤色から濃い赤色)、または SUC1-Q50A (淡い青色から濃い青色) プロテオリポソームの SSM ベースの電気生理学からの生の電流トレース示された対称 pH で。プロットはピーク電流を示しています。ボックスは 25 パーセンタイルから 75 パーセンタイルまで広がり、中央値が表示されます。ひげは最小値と最大値まで伸びます (n = 3、データポイントは個別の実験です)。 WT、野生型。

ソースデータ

SUC1によるスクロースの能動輸送はプロトン駆動であり、卵母細胞アッセイではプロトン脱共役剤であるシアン化カルボニルm-クロロフェニルヒドラゾンに感受性があります（拡張データ図8a）。トランスポーターでは、膜貫通領域に埋もれた酸性残基がプロトン輸送に一般的に不可欠です 35。 SUC1の膜貫通ドメインでは、唯一の酸性残基はAsp152(M4)であり、これはSUC内で厳密に保存されているため、シンポート中のプロトンドナー/アクセプター残基としての主要候補です（図2bおよび拡張データ図1および6）。。 Asp152 は、他の残留物と密接に接触することなくキャビティ溶媒にさらされます (図 2b)。 Asp152をアスパラギンに変異させると、in vivoでの細胞膜局在に影響を与えることなく輸送活性が失われました（図2cおよび拡張データ図9）。予想どおり、この変異体は、リポソーム内の野生型SUC1で観察される電流応答も妨害し、中心的なプロトン供与体/受容体としての重要な役割を裏付けています（図2dおよび拡張データ図8b）。膜貫通プロトン移動のもう 1 つの一般的な要件は、プロトン供与体/受容体の pKa 制御であり、これは多くの場合、正に帯電した残基によって媒介されます 35、36、37、38。ただし、SUC1 の外側に開いた状態では、この関数の明確な候補はありません。

内向きの状態を取得するために、さまざまな人工知能 (AI) ベースのタンパク質構造予測ツールを使用しようとしましたが、実験構造 (Cɑ 1.6 ～ 2.5 Å の rmsd) に類似した外向きの立体構造のみが得られました。しかし、構造において、細胞内側のNドメインとCドメインの間に、外側に開いた状態を安定化する塩橋のネットワークが存在することを確認しました（拡張データ図6および7a）。これらの相互作用を破壊すると、輸送活動が不活性になるか、大幅に低下します（拡張データ図7b）。我々は、これらの変異によってタンパク質が内向きの状態で安定化されたと推測し、この情報をAIベースのタンパク質構造予測ツールに導き、内向きの開いた立体構造を生成させたと推測した（拡張データ図7a）39,40。この内向きに開いた立体構造の予測に基づいて、厳密に保存された Gln50(M1) が Asp152 の pKa を制御する有力な候補であることを示唆します (拡張データ図 7c)。構造内でアスパラギン酸塩から8.2Å離れているにもかかわらず、Gln50はM1の動きによってシフトし、予測された内向き開放モデルでAsp152と水素結合を形成しました（図2bおよび拡張データ図7c）。 Gln50をアラニンに置換すると、卵母細胞のD152Nに匹敵する程度の輸送活性が失われました（図2c）。付近の他の残基を変異させると、Q50A 変異体と同等の輸送損失をもたらした Trp47 の置換を除いて、輸送活性の低下はまったく示されないか (Cys74)、輸送活性の多少の低下が示されました (Ser78 または Gln456)。 .2c)。さらに、D152N変異体と同様に、Q50A変異体もリポソーム中で野生型SUC1と比較して電流応答とpH依存性の同様の喪失を示しました（図2d）。これに基づいて、我々は、Asp152が、プロトン部位のpKa変化を制御するGln50に関与する可能性があるシンポート中のプロトン移動を担うプロトンアクセプター/ドナーであると提案します。

ここから、V 字型の空洞にあるスクロース結合部位に注目しました。キャビティ内およびプロトン部位の近くには、スクロース結合に関与する可能性のある N ドメインと C ドメインの両方の一連の残基が明らかに存在します (図 3a)。

a、図2aに示すように、青で輪郭を描いたスクロース結合ポケットの拡大図。 b、スクロースの同定された安定な結合姿勢から開始して、それぞれAsp152(H)およびAsp152(-)について5回の独立したMDシミュレーションを繰り返した結果。繰り返しは、スクロースが安定した姿勢で結合した時間の割合によって要約されるように、一貫した結果を示します。右、シミュレーションの繰り返し 2 がピンとしてスクロースを示し、頭がグルコシル部分を表しています。以下はスクロースのrmsdプロットです。 rmsd プロットの背景は、スクロースの結合 (濃青色) または非結合 (水色) のポーズを示します。 c、Asp152(H)を使用したMDラン2におけるスクロース原子とSUC1残基間の接触マップ。水素結合相互作用 (青) と疎水性相互作用 (赤) を含む、シミュレーション時間の少なくとも 25% の間に発生した相互作用のみが表示されます。 d、Asp152(H)を使用したシミュレーションにおけるスクロース安定姿勢の代表的なスナップショット。青いダッシュは水素結合を示し、赤いダッシュは疎水性相互作用を示します。 e、パネルdに示すスナップショットにおけるSUC1によるスクロース配位の概略図。 f、スクロース結合ポケットの内側を覆う残基を標的とするSUC1変異体の卵母細胞取り込みアッセイ。取り込み活性は野生型の活性に対して正規化されています。バーは平均±標準偏差です。点は生物学的に独立した実験を表します（Q44AおよびF184Aについてはn = 5; F298A、F427A、N449AおよびQ456Aについてはn = 6; N155A、N156A、R163A、M188A、F423A、S431AおよびI452Aについてはn = 7; n W294A の場合は = 10、WT および Q159A の場合は n = 12、T290A の場合は n = 14、Q83A の場合は n = 18）。野生型と変異型間の差異の P 値は、一元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続くダネットの多重比較検定から得られました。 P値を図に示します。 NS、重要ではありません。

ソースデータ

スクロースの結合モードと中央結合ポケット内の残基の機能的役割を評価するために、スクロース分子を使用した MD シミュレーションを実行して、スクロースの安定な結合姿勢を特定しました。ガイダンスとして、スクロースの開始ポーズは、既知の最も近い構造相同体、つまり基質結合状態を模倣すると提案されているガラクトシル含有メリビオース類似体と結合したメリビオース/カチオン共輸送体 MelB に基づいています (配列同一性 15.7%) (拡張)データ図10a)。プロトン化された Asp152 (Asp152(H)) または脱プロトン化された Asp152 (Asp152(-)) と MelB にインスピレーションを得た構造に配置されたスクロースを使用して、SUC1 に対してそれぞれ約 1 μs (合計 14.3 μs) の 10 回および 5 回の独立したシミュレーションを実行しました。ポーズ。すべてのリピートにおいて、タンパク質は安定した挙動を示しました（拡張データ図 10a、b）。

これらのシミュレーションのほとんどは、静的なショ糖結合ポーズをキャプチャしておらず、ショ糖は空洞の周りを自由に移動します。しかし、Asp152(H)を伴うリピートの1つでは、スクロースのグルコシル部分は、1,050nsを超えてNドメインに向かう静的な姿勢で安定しました(拡張データ図10c)。このポーズがスクロース分子の安定した初期結合イベントに似ているかどうか、またこれがプロトン化される Asp152 に依存するかどうかを調べるために、Asp152(H) または Asp152(-) を使用した 5 つの新しいシミュレーション (合計 10.6 μs) をスクロースを配置した状態で実行しました。この新しい結合位置にあります (拡張データ図 10d)。 Asp152(H)を有する5つのリピートのうち4つでは、スクロースは安定した結合姿勢を維持したが、Asp152(-)リピートでは容易かつ迅速に放出された(図3bおよび拡張データ図10e)。また、Asp152(H) を含むリピートでは、スクロースは解離イベント後に特定された結合姿勢に戻ります。独立したシミュレーションからの接触のマッピングは、この初期の安定した結合姿勢において、スクロースがAsp152(H)および残基Trp47、Gly75、Asn155およびAsn156のグルコシル部分と特異的かつ直接相互作用することを示している（図3c〜eおよび拡張データ）図10d)。接触分析は、スケールにおいて匹敵する他の結合部位がないことを明確に示しています。接触マップは、O2、O3、およびO4の位置でグルコシルヒドロキシルと水素結合が形成され、これにより基質認識が与えられることを示しています。さらに、疎水性相互作用はグルコシルとの結合に寄与し、最初はある程度フルクトシルとの結合にも寄与します。まとめると、シミュレーションにより、初期結合イベントのトリガーとしてスクロースのグルコシル基が特定され、初期選択性が生み出されたため、トランスポーター内で直接スクロース結合を安定化させるためには Asp152(H) が重要であることが示唆されました。

MDによって示唆された相互作用をテストし、輸送に対するそれらの機能的重要性を調べるために、次に、提案された残基と空洞を裏打ちする他の残基の生化学的特徴を決定しました（図3a、d–f）。我々の結果は、初期結合の中心であると予測される残基が輸送に不可欠であることを裏付けています。 Asn156の変異により、卵母細胞の輸送が完全に失われ、これはスクロースのグルコース部分の調整におけるAsn156の顕著な役割と一致しています（図3f）。グルコシル部分については、接触マップにより Gly75 の主鎖、Trp47 および Asp152(H) の側鎖も特定され、変異すると輸送活性が失われることがわかりました (図 2c)。同定されたフルクトシル接触については、Asn155 の突然変異誘発は輸送活性にほとんど影響を及ぼさなかったことから、この残基への水素結合、および初期結合姿勢におけるフルクトシル部分との特異的相互作用は輸送全体にとってそれほど重要ではないことが示されました。同定された他の接触については、Gln159の変異は影響を及ぼさなかったが、Asn449の変異により輸送が排除された（図3c、f）。また、スクロース結合に近いがまだ関与していない、同定された結合部位内の残基も標的としました（図3a）。極性残基Gln83およびThr290の変異はマイナスの影響を及ぼさなかったが、極性残基Gln44、Ser431およびGln456を変異させると輸送が実質的に減少した(図3f)。さらに、疎水性残基Phe184、Trp294、Phe298、Phe423、Phe427またはIle452の突然変異誘発も同様に輸送を減少させた(図3f)。興味深いことに、Arg163またはMet188の変異は、同様に空洞の底に位置するAsn449と同様に輸送の完全な喪失をもたらし、完全に閉塞された状態でのこれら3つの残基の役割を一緒に示しています（図3f）。まとめると、これらのデータは、プロトン化された SUC1 の MD シミュレーションで観察された安定したスクロース結合姿勢が初期結合イベントを表すことを裏付けています。 SUC1による最初の基質認識はグルコシル部分への水素結合に焦点を当てていますが、中央結合ポケットを構成する他の残基は輸送サイクルの後期段階で役割を果たします。

これらの結果をさらに裏付けるために、卵母細胞アッセイとSSMベースの電気生理学の両方を使用して、さまざまな推定リガンドを使用してSUC1の基質特異性をテストしました（図4a〜c）。私たちはグルコシルを持つ分子と持たない分子の両方をテストしたところ、グルコシル部分は基質に必要な資産であるのに対し、フルクトシル部分は部分的な極性特性を持つ環状基でより容易に置換できることがわかりました（図4）。これらの結果は、SUC1 が初期の安定な結合姿勢でスクロースのグルコース単位と相互作用し、フルクトース単位の特異的認識が輸送活性にとってそれほど重要ではないという結合モデルと一致しています。

a、pH 5.5で1 mMスクロースおよび20倍の競合基質を用いた卵母細胞における競合アッセイによって決定されたSUC1の基質特異性。対照（競合のないスクロース取り込み）と様々な競合化合物によるスクロース取り込みとの間の差のＰ値は、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くダネットの多重比較検定から得た。 P値を図に示します。バーは平均±標準偏差です。データポイントは個別の実験です（スクロース取り込み、スクラロース、ラフィノース、ソルビトールについては n = 4、他のすべての化合物については n = 5、タンパク質なしについては n = 7）。 b、SSMベースの電気生理学によってpH 5.5で測定されたSUC1の基質特異性。 10 mMで試験した一連の推定基質によって誘発されたピーク電流。ピーク電流は、アーチファクト信号補正後にショ糖誘発電流に対して正規化されました。現在の応答の P 値は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定から得られました。 P値を図に示します。 * で示された電流応答はスクロースとは大きく異なり、おそらくトランスポーターのリガンドではなく、スクロースよりも低いピーク電流を誘発するか、またはより高いピーク電流応答を誘発することを示しています。バーは平均±標準偏差です。 n = 4。点は個々の測定値を表し、すべての測定は単一のセンサーで実行されました。 c、基質のスクリーニングに使用される配糖体の化学構造。スクリーニングには、単糖類 (青)、二糖類 (緑)、オリゴ糖 (黄)、糖アルコール (ピンク)、およびその他のグルコシド (オレンジ) が含まれます。 pNP-α-d-glc、p-ニトロフェニル α-d-グルコピラノシド; pNP-β-d-glc、p-ニトロフェニルベータ-d-グルコピラノシド。

ソースデータ

私たちの構造解析、機能研究、MD シミュレーションデータは、スクロースが SUC1 によってどのように認識されるかのモデルを提供し、機能に必要なプロトン結合部位などの重要な構造要素を特定します。推定されるプロトンアクセプター/ドナーAsp152は、SUT/SUCファミリーのメンバーにおいて厳密に保存されており(拡張データ図1および6)、SUC1のショ糖誘導性輸送電流および対応するイネオルソログOsSUT1にとって重要であることが以前に報告されている(参考文献31、41）。 SUC1 は、他の既知のプロトン共役シンポーターとは明らかな違いを示し、シンポートの独自のモデルを提示します。まず、プロトン部位と基質結合部位の間の直接結合。第二に、我々が示唆する M1 ヘリックス上の Gln50 は、M4 ヘリックス上の Asp152 の pKa を制御し、他のプロトン輸送体で観察されるような、この機能に塩基性残基を使用する一般的なパターンを破ります 14,35,42。これら 2 つの要因により、糖の結合はプロトンの結合に直接関連付けられるようになり、プロトンが解離する限り、非常に高いスクロース濃度の環境への糖の放出が可能になります。この設定は、以前に報告された反応速度モデル 34,43 に従って、プロトンとスクロースの結合比が 1:1 であることを示唆しています。我々のデータは、N ドメインから基質のグルコシル部分への緊密な極性相互作用を可能にするために、Asp152 のプロトン化が必要であることを示唆しています。

この緊密で直接的な結合は、SUT/SUC ファミリーのメンバーが極端なモルレベルのショ糖濃度でどのように機能するかを説明するための中心軸となります。 SUC1 の低い親和性は、高容量のスクロース輸送の前提条件であり、結晶学と MD の両方で基質結合状態を捕捉する際の課題から明らかです。それにもかかわらず、我々の研究は、スクロースの最初の認識がグルコシルとプロトン化されたNドメインとの相互作用によって媒介されることを示唆している。これは、グルコシルヒドロキシル基が基質認識の中心であるという以前の発見と一致しています44、45、46、47。また、N ドメインと C ドメインの両方の残基が、全輸送サイクル中に中央結合ポケットで重要な役割を果たしていることがわかりました。寄与する残基の分布は、結合ポケットを 2 つの半分に分けます。一方の半分は、主に N ドメインからの極性相互作用に寄与します。一方、後半は主に C ドメインに由来する疎水性特性を示します (図 3a)。これは、動物グルコーストランスポーター (GLUT) やシュガーポーターファミリーの植物糖輸送タンパク質 (STP) などのグルコーストランスポーターの結合様式とは対照的です。ここで、C ドメインは、単糖との極性相互作用を通じてほとんどの接触を仲介します 36、42、48、49。プロトン駆動型 STP では、N ドメインが遠位プロトン部位を中央結合部位でのグルコースの高親和性結合に間接的に結び付けます 36。

SUC1 構造では、結合キャビティの底にある完全に保存された Arg163 が、Phe423(M10) の主鎖および Asn181(M5) の側鎖と水素結合を形成することにより、安定化ゲートのような役割を果たします。リジンへの置換は輸送活性を補完できず、輸送におけるアルギニンの中心的な役割を示しています（拡張データ図6および7）。さらに、重要なジスルフィド架橋によって安定化された EHR の両親媒性ヘリックスと、IHR の両親媒性ヘリックスは、異なる構造的特徴です。卵母細胞アッセイで IHR を破壊しても明らかな効果はありませんでしたが、EHR を破壊すると活性がなくなりました。以前の研究では、酸化剤が輸送体の活性を高めるのに対し、システインの SH 基に共有結合する p-クロロ水銀ベンゼンスルホン酸は輸送活性を強く阻害することがわかっています 5。これらの観察は、SUC の二量体化に関連していると提案されています。我々の結果は二量体化の可能性について直接言及したものではなく、輸送活動に関するこれまでの観察は、我々が観察したEHRにおけるジスルフィド架橋の重要な役割によって完全に説明することができる。しかし、これらの両親媒性領域の正確な役割および二量体化の可能性との関係は依然として不明である(拡張データ図5)。 SUC1 の構造は、SUC1 輸送活性が示す pH および膜電位への線形依存性の生理学的機能も示唆しています 6,34,50。この依存性は、たとえば、pH 5.5 付近に標準的な最適 pH を持つ SUC2 と比較すると異なります (参考文献 6、51)。 SUC1はシンク強度を制御するために急速な師部後スクロース輸送が必要なシンク組織に結合しているため、基質輸送におけるプロトン結合への直接の1:1依存性は意味がある。 SUC1 で観察されるプロトンの緊密な結合は、駆動基質濃度であるプロトン濃度がスクロース転座と直線的に関連しており、高濃度勾配に抗して放出できることを意味します 52。アポプラストの pH の変更は、アポプラストの低い受動緩衝能によってサポートされる SUC1 のトランスポーター活性を調節および最適化するために、植物によって応答的に使用される可能性があります 51。侵入病原体の糖トランスポーターと競合するときにアポプラストを酸性化すると、SUC1の輸送能力と見かけの親和性の両方が増加し、同時に病原体トランスポーター活性の低下が促進されます。

GPHファミリーは一価カチオン駆動のシンポーターファミリーであり、私たちの研究は、プロトン駆動の輸送に対応するために植物内でこの構造がどのように変更されたかを説明しています。細菌のメリビオース/Na+ 共輸送体 MelB および動物のリゾホスファチジルコリン/Na+ 共輸送体 MFSD2A21,53,54 の既知の構造では、Asp152 と同等の位置にある残基が保存されたナトリウム結合部位の一部を形成しており、MelB はカチオンの乱れさえ示します。部分は基質の選択性を決定します。ヒト溶質キャリアファミリー 45 (SLC45) も SUT/SUC ファミリーに関連しており、メラニン合成および一連の関連疾患に関連しています。 SLC45A2 では、Asp152 に相当する残基の変異により眼皮膚白皮症が引き起こされ、これもまた界を越えたオルソログにおけるアスパラギン酸の重要な役割を裏付けています 55。さらに、Arg163 と同等の残基は、リガンド結合 MelB 構造における基質結合において重要な役割を果たしており、哺乳動物の MFSD2A における変異は致死的であり、GPH ファミリー内のこの位置の重要な役割を再度実証しています 54,56。

私たちのデータに基づいて、SUCは輸送中の基質認識のための次の機構モデルを備えた交互アクセス機構によって動作すると提案します（図5）。外向きに開いた状態では、大きな空洞がアポプラスト側に向かって開いており、スクロースとプロトンの進入が可能になります。スクロースは、Asp152 および周囲の残基に対してネストされたグルコシル部分とともに沈降します（図 3d–e）。このグルコシル部分への最初の低親和性結合は、Asp152 のプロトン化に依存しています。スクロースとプロトンが結合した後、Arg163 とその他の結合ポケット残基は、基質認識の後期段階でさらなるスクロース接触を引き起こします。これは、以前の研究と一致して、最初のグルコシル認識部位とその後のスクロース転座への Arg163 の関与を含む 2 段階の認識スキームを形成します 57。この認識設定は、基質の二次糖に対するより広範な基質の無差別性も説明します。グルコシルは比較的不変ですが、フルクトシルはより容易に交換できます (図 4)。トランスポーターの移行中、塩橋の細胞内ネットワークは壊れますが、細胞外側では、荷電した極性残基がヘリックス間の接触を形成し、アポプラスト側からの空洞の閉鎖と内部状態への安定化を確実にすることが予想されています。モデルと卵母細胞の突然変異誘発研究 (拡張データ図 7a、b)。内側に開いた後、Gln50 によって指示された pKa の変化により、Asp152 の脱プロトン化が起こり、スクロース放出が促進されます。

N ドメインと C ドメインは SUC1 構造に従って色付けされており、強調表示された M1、M4、M7、および M10 が漫画として示されています。スクロースは緑と青で示され、プロトンは青い球として示されています。

結論として、我々の研究は、SUT/SUCファミリーのプロトン結合部位としてAsp152を特定し、グルコシルの最初の認識を伴うスクロース結合が、この部位でのプロトン結合への直接結合を介してどのように達成されるかを示した。私たちは、トランスポーター機能の重要な要素と特性を特定し、糖シグナル伝達、ストレス応答、維管束植物におけるスクロースやその他の溶質の維管束運動の背後にある中心的な原動力の背後にある中心的な分子機構を説明します。

A. thaliana SUC1 (UniProt: Q39232) cDNA を、C 末端トロンビン切断部位とデカスチジン精製タグを備えた p423-GAL1 に基づく発現構築物に導入しました。形質転換された S. cerevisiae (DSY-5 株) を培養容器内で流加培養により高密度まで増殖させ、ガラクトース 58 を使用した 22 時間の誘導後に回収しました。回収した細胞を冷水で洗浄し、遠心分離し、緩衝液（100 mM Tris pH 7.5、600 mM NaCl、1.2 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド）に再懸濁し、続いて溶解するために0.5 mm ガラスビーズでビーズビーティングしました。ホモジネートを17,568gで20分間遠心分離し、続いて200,000gで2時間超遠心分離して膜を沈降させた。細胞膜をホモジナイズし、緩衝液（50 mM Tris pH 7.5、500 mM NaCl、20% グリセロール）に再懸濁した後、液体窒素中で凍結し、-80 °C で保存しました。解凍した細胞膜を、1% (w/v) n-ドデシル-β-d-マルトシド (DDM) および 0.1% を含む緩衝液 (150 mM NaCl、50 mM Tris pH 7.5、5% (v/v) スクロース) に可溶化しました。 (w/v) コレステロールヘミスクシネート (CHS) を 4 °C で 30 分間。 5,000gで10分間の遠心分離により不溶性物質を除去し、1.2μmフィルター(PALL)を使用して上清を濾過した。上清に20 mMイミダゾール(pH 7.5)を補充し、5 ml Ni-NTAカラム(GE Healthcare)に3 ml min-1でロードした。カラムを10カラム容量の緩衝液(0.1% DDM、0.01% CHSおよび90 mMイミダゾールpH 7.5を補充した可溶化緩衝液)および20カラム容量の緩衝液(20 mM Tris pH 7.5、250 mM NaCl、5%(v))で洗浄した。 /v) 40 mM イミダゾールを添加したスクロース、0.02% (w/v) DDM、0.002% (w/v) CHS および 0.5 mM トリス(2-カルボキシエチル) ホスフィン (TCEP)) (pH 7.5)。 500 mM イミダゾール (pH 7.5) を含む同じ緩衝液でタンパク質を溶出し、溶出したタンパク質サンプルをプールし、ウシトロンビンを補充した後、緩衝液 (20 mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸 (MES) 中で 4 °C で一晩透析しました。 ) pH 6.0、250 mM NaCl、5% (v/v) スクロース、0.02% (w/v) DDM、0.002% (w/v) CHS および 0.5 mM TCEP)、12 ～ 14 kDa の分子量カットオフを使用 ( MWCO) チューブ (スペクトラム)。翌日、タンパク質に50 mM Tris (pH 7.5)を補充し、5 ml Ni-NTAカラム(GE Healthcare)にロードして、精製タグおよび夾雑物を除去した。タンパク質を、４０μＭを添加した緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、２５０ｍＭＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）スクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＣＨＳおよび０．５ｍＭＴＣＥＰ）を用いて回収した。 mM イミダゾール (pH 7.5)、50 kDa MWCO スピンカラム (Vivaspin) を使用して濃縮し、緩衝液 (20 mM MES pH 6.0、250 mM NaCl、5% (v) 中で Superdex 200 Increase 10/300 GL カラム (GE Healthcare) に供した／ｖ）スクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＣＨＳおよび０．５ｍＭＴＣＥＰ）。サイズ排除バッファーの組成は、サンプルの安定性のために最適化されました 59。ピーク画分をプールし、50 kDa MWCO スピンカラム (Vivaspin) を使用してタンパク質を 14 mg ml-1 まで濃縮しました。

SUC1 は脂質立方相で結晶化されました。シリンジミキサーを使用して、精製タンパク質をモノオレイン (Sigma) とタンパク質対脂質の比 1:1.5 で混合しました。結晶化のために、50 nl のメソ相を、43.5% ポリエチレングリコール 400 (v/v)、0.25 M リン酸二水素アンモニウムおよび 0.15 M ビス-トリスプロパン (pH 6.3) を含む結晶化緩衝液 1000 nl と、ガラスサンドイッチプレート上で混合しました。グリフォンロボット (Art Robbins Instruments)。脂質立方相結晶は 1 ～ 2 日後に出現し、19 °C で 1 週間以内に 100 × 10 × 30 µm のフルサイズに成長しました。 Dual Thick MicroMounts LD (MiTeGen) を使用して結晶を収集し、液体窒素で急速冷凍しました。

広範なスクリーニングの後、最終的なデータセットは、20 × 20 µm のビームを使用してダイヤモンド光源マイクロフォーカスビームライン I24 で収集されました。単結晶は、波長 1.0 Å の X 線で 0.10° の振動角で 360° 回折されました。データセットは、三斜晶系空間群 P1 (点群 1) の XIA2 パイプライン 62 を介して DIALS60 および AIMLESS61 を使用して処理およびスケーリングされました。これにより、溶媒含有量が約 56% の非対称ユニットに 2 つの SUC1 分子が存在することが示唆されました。位相問題を解決する試みとして、MFS メンバーの既知の構造から生成された 65 の検索モデルが分子置換に使用されました。しかし、構造解法に適した解は得られなかった。位相問題は、PHASER63 と RoseTTAFold 予測 64 SUC1 モデルを使用した分子置換によって解決されました。モデルの rmsd 推定値は、SCULPTOR65 を使用して検索モデルを最終的に修正する前に、B 因子に変換されました。この検索では、翻訳関数 Z スコア 9、分解能カットオフ 3.5 Å での対数尤度ゲインスコア 259 の解が得られ、非対称ユニット内の 2 つの分子が非生理的二量体を形成しており、初期 Rfree 計算は 52% でした。 Refmac66で。 CCP4 スイート 68 の Parrot67 を使用して、検索モデルのバイアスを低減するために、Refmac による初期改良とヒストグラムマッチング、溶媒平坦化および異方性補正による密度修正が行われました。電子密度マップにより、Coot69 での反復モデル構築と、2mFO-DFc マップを使用した phenix.refine を使用した改良が可能になり、モデルフェーズを使用して機能拡張マップ 70 が生成されました。個々のサイト、個々の原子変位パラメータ (ADP)、およびグループ移動 - リブレーション - ネジ (9 つのグループ) および 35 個の反射を伴う最尤ターゲットに対する非結晶学的対称拘束のリファインメント戦略を使用して、phenix.refine で最終リファインメントを実行しました。 –2.68 Åの分解能範囲。最終モデルでは、自由 R 係数 (Rfree) 29.30%、R 係数 (Rwork) 26.96% が得られました (補足表 1)。ラマチャンドランプロットの MolProbity71 評価では、良好な領域で 98.31%、外れ値で 0.13% が得られました。図は、ChimeraX v.1.4 (参考文献 72) を使用して作成されました。配列アラインメントは PROMALS3D73 を使用して構築されました。アライメントは、ALINE v.1.0.025 (参考文献 74) を使用して視覚化されました。進化的配列保存は ConSurf75 を使用して分析されました。クーロン静電ポテンシャルは、ChimeraX v.1.4 (参考文献 72) で計算されました。

クロロホルム (Avanti) 中の大豆極性脂質抽出物 (組成 (w/w)、45.7% ホスファチジルコリン、22.1% ホスファチジルエタノールアミン、18.4% ホスファチジルイノシトール、6.9% ホスファチジン酸および 6.9% 他の大豆脂質) を乾燥させ、再構成緩衝液 (30 mM) に再懸濁しました。 HEPES pH 7.4、140 mM NaCl および 5 mM MgCl2)。リポソームを孔径 0.4 μm のポリカーボネート膜 (Millipore) を通して押し出すことによって均質化し、n-オクチル-β-d-グルコシド (Anatrace) を最終濃度 1% (v/v) まで添加しました。リポソーム懸濁液を水浴中で１分間３回超音波処理し、各超音波処理の間に氷上で１分間インキュベートした。精製タンパク質をリポソームに添加し、脂質:タンパク質比が 5 になるように計算しました。界面活性剤 n-オクチル-β-d-グルコシドは、ロータリーシェーカーを使用して 400 mg ml-1 Bio Beads (Bio-Rad) とともに 4 °C で一晩インキュベートすることによって除去しました。プロテオリポソーム (5 mg ml-1) を液体窒素中で急速冷凍し、-80 °C で保存しました。

SSM ベースの電気生理学は、SURFE2R N1 (Nanion Technologies) で実行されました。すべての実験で、センサーの準備は記載どおりに実行されました 76。プロテオリポソームを非活性化バッファーで 1:5 に希釈し、ウォーターバスで 10 秒間超音波処理を 3 回行い、3 mm センサーに適用した後、2,100 g で 30 分間、4 °C で遠心分離しました。糖滴定アッセイでは、非活性化バッファーと活性化バッファーの両方を同じメインバッファー (所定の pH 値の 5 mM MgCl2 および 100 mM リン酸カリウムバッファー) から調製しました。非活性化バッファーには、SUC1 によって輸送されない構造的に関連した分子である 810 mM マンニトールが補充されました。活性化緩衝液は、810 mM スクロースを加えて等モルで調製し、続いて非活性化緩衝液で希釈して、1 回の実験で使用するすべての溶液の浸透圧を一定に保ちました。単一ソリューション交換ワークフローが使用されました。データ点は 3 つの独立した測定値の平均を表します。基質特異性の測定では、非活性化バッファーと活性化バッファーをメインバッファー pH 5.5 から調製し、活性化バッファーには 10 mM の目的の基質が含まれていました。アッセイは、SUC1 に由来する電流と、SSM と相互作用するさまざまな成分によって誘導されるアーチファクト電流を区別するために、サンプル膜とネガティブコントロール膜の両方で実行されました。個々の基質ごとに SUC1 輸送電流を決定するために、所定の基質について測定された電流から、対応するネガティブコントロールの平均値が差し引かれました。データは、単一のセンサーで実行された 3 つの独立した測定の平均を表し、ショ糖測定に従って正規化されました。対称的な pH 条件下での測定には、単一溶液交換構成が使用されました。プロテオリポソームの内部 pH を外部 pH に調整するために、異なる pH 値での測定の間にサンプルを所定の pH で 6 分間インキュベートしました。ピーク電流は、10 mM スクロースを含む所定の pH の活性化緩衝液の添加時に測定されました。各センサーについて、さまざまな pH 値での測定後、初期の中性 pH でのセンサーのシグナルが再度測定され、たとえば、さまざまな pH でのタンパク質の安定性の低下によって引き起こされる、pH 滴定中の潜在的なシグナル損失が評価されました。これらのシグナル振幅は初期測定値と同等であり、トランスポーター活性が実験全体を通じて維持されていることを示しています。実験は少なくとも 3 回実行され、データは GraphPad Prism v.9 で分析されました。 Michaelis-Menten フィッティングは、カーブフィッティング分析と Km の決定に使用されました。エラーバーは標準偏差を表します。ピーク電流信号は、電流の結合、輸送、および遮蔽または中和による起電性イベントの複合効果である可能性があるため、原稿全体を通じてスクロース輸送にのみ Kmapp パラメーターを使用します。最大有効濃度の半分。 symport には複数の基質 (この場合はスクロースと H+) があります。 2 つの基質の場合、1 つの基質の Km 値は原則として、2 番目の基質の無限濃度への外挿によって決定されます。したがって、Kmapp の「app」を使用して、スクロースについて決定された Km 値が定義された pH で特に適用されることを強調します。

A. thaliana SUC1 (UniProt: Q39232) cDNA を pNB1-U ベクター 77 と、C 末端の 10 残基のグリシン - セリンリンカーとそれに続く eGFP をコードする遺伝子配列を保持するベクターの GFP 融合変異体にクローニングしました。すべての突然変異は、Q5 ポリメラーゼ (New England Biolabs) を使用した部位特異的突然変異誘発を使用して作成されました。 cDNAの調製では、5'および3'非翻訳領域を含む標準プライマー（順方向、TTAACCCTCACTAAAGGGTTGTAATACGACTCACTATAGGG;逆方向、TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATACTCAAGCTAGCCTCGAG）を使用したPCRによって遺伝子を増幅し、続いて1％アガロースゲルで分離した後PCR精製（GeneJET PCR Purification、Thermo Fisher）を行いました。 mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) を使用した in vitro 転写によって RNA を合成しました。 RNA注入用のキャピラリー針は、PC-10マイクロピペットプーラー(Narishige)を使用して作成しました。発現のために、Nanoject III (Drummond Scientific) を使用して Xenopus laevis 卵母細胞 (EcoCyte Bioscence) にそれぞれ 25 ng の RNA を注入し、続いて ND-96 緩衝液 (96 mM NaCl、1 mM MgCl2) 中で 16 °C で 3 日間インキュベートしました。、２ｍＭＫＣｌ、１．８ｍＭＣａＣｌ２、５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４）と１０ＩＵｍｌ−１ゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。濃度依存性取り込みアッセイでは、ND-96 反応緩衝液 (96 mM NaCl、1 mM MgCl2、2 mM KCl、1.8 mM CaCl2、5 mM MES pH 5.5) 中の 0.1 ～ 20 mM の範囲のスクロース濃度を使用し、[14C ]スクロース（PerkinElmer）を各糖溶液に1μCi ml-1の濃度で添加した。取り込みアッセイの前に、卵母細胞を洗浄し、反応バッファー中で 5 分間プレインキュベートしました。取り込みアッセイでは、卵母細胞を所定のスクロース濃度の反応緩衝液中で 30 分間インキュベートしました。特に明記しない限り、すべてのアッセイは pH 5.5 で実施されました。１００ｍＭスクロースを補充した氷冷反応緩衝液を添加することによって反応を停止し、その後すぐに氷冷反応緩衝液中で卵母細胞を洗浄した。対照として、RNAの代わりに純水を注入した卵母細胞を同様の方法でインキュベートしました。競合アッセイでは、反応バッファーは 1 μCi ml-1 [14C]スクロース、0.5 mM スクロース、および 20 倍高濃度の競合糖 (10 mM) で構成されました。変異体の取り込み活性アッセイおよび pH 依存性取り込みアッセイの場合、反応バッファーは 1 μCi ml-1 [14C]スクロースおよび 1 mM スクロースで構成されました。 pH 依存性アッセイの場合、反応バッファーには、目的の pH に調整された 50 mM リン酸カリウム、または変異体の pH 依存性アッセイでは pH 3.5、4.5、または 5.5 に調整された 25 mM クエン酸が補充されました。時間依存性取り込みアッセイでは、濃度 675 μM スクロース (Sigma-Aldrich) を使用し、[14C] スクロースを最終濃度 1 μCi ml-1 まで添加しました。各卵母細胞を単一の実験として処理しました。卵母細胞を個別にシンチレーションバイアルに移し、100μlの10% SDS溶液を加えてすぐにボルテックスすることによって破壊した。 3 ml の OptiPhase HiSafe 3 シンチレーション流体 (PerkinElmer) を各サンプルに添加し、Tri-Carb 4910TR 液体シンチレーションカウンター (PerkinElmer) を使用して放射能を定量しました。実験は少なくとも 3 回実行され、データは GraphPad Prism v.9 を使用して分析されました。 Michaelis-Menten フィッティングは、カーブフィッティング分析と Km の決定に使用されました。エラーバーは標準偏差を表します。タンパク質の局在が点突然変異誘発によって影響されたかどうかを判断するために、C末端eGFP融合野生型および変異体の細胞局在を共焦点レーザー走査顕微鏡で分析しました。画像は、オペレーティングソフトウェア ZEN v.3.5 を備えた Zeiss LSM 780 Axio Imager 2 共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して取得されました。励起波長 488 nm の 10 倍対物レンズを使用し、フレーム時間 7.75 秒で 2.55% のレーザー出力を使用し、注入後 3 日目の卵母細胞の光学スライスの 4 分の 1 を表示しました。 symport には複数の基質があるため、SSM ベースの電気生理学アッセイで説明したように Kmapp 値を使用しました。

分子置換フェーズに使用した RoseTTAFold の予測モデルと AlphaFold v.2 の予測モデルはどちらも、実験構造に対する Cɑ 原子の rmsd が 1.6 ～ 2.5 Å の範囲で外側に開いた立体配座を示します。したがって、AI が予測したモデルは、少なくとも構造の中核部分については非常に正確です。 Asp152 の pKa に影響を与えてプロトン化状態に影響を与える可能性のある残基を特定するために、AlphaFold v.2 (参考文献 39) を使用して SUC1 の代替立体構造をサンプリングしました。これは、入力多重配列アラインメント (MSA)40 の深さを減らし、安定化するドメイン間塩橋ネットワークの細胞内ネットワークの残基である Arg99、Arg100、および Arg357 にアラニン変異を導入することで SUC1 入力タンパク質配列を変更することによって行われました。外向きに開いた立体配座のSUC1。予測実行は、AlphaFold2_advanced ノートブック 78 を使用する ColabFold サーバー経由で、AlphaFold v.2.0.1 を使用して実行されました。すべての MSA は MMSeqs2 サーバー 79 を使用して取得され、max_msa_clusters はランダムに選択された 32 個のシーケンスクラスターに減らされ、max_extra_msa は追加の要約統計量を計算するために使用される 64 個の追加シーケンスに減らされました。すべての予測モデルは、予測に従って Amber-Relax の対象となりました。

SUC1 の結晶構造の鎖 A は、最初に Maestro v.13.0 を使用して処理されました。イオン化可能残基のプロトン化状態は、PROPKA80 を使用して決定されました。トランスポーターのアポプラスト側は pH 5、細胞質側は pH 7 でした。互変異性体の選択を考慮すると、水素結合が最適化されました。 Asp304 (pKa 7.47) はプロトン化されたものとしてモデル化されました。 His65 (pKa 6.19)、His205 (pKa 5.90)、および His390 (pKa 6.25) はアポプラスト環境に曝露されたため、イミダゾール環の Nδ と Nε の両方でプロトン化されました。 His89 (pKa 6.14) は細胞質に面しており、Nε 上でのみプロトン化されました。中央空洞に位置する Asp152 (pKa 6.50) は、プロトン化 (Asp152(H)) 状態と脱プロトン化 (Asp152(-)) 状態の両方にあると考えられました。観察されたジスルフィド架橋は、Cys216 と Cys220 の間でモデル化されました。

SUC1 は z 軸に揃えて立方体ボックス (90 × 90 × 118 Å3) に配置され、x-y 平面内で 188 個の 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン脂質に囲まれました。タンパク質 - 膜系は、3 点 (TIP3P) 水 81 および電荷中和 150 mM NaCl による移動可能な分子間ポテンシャルで溶媒和されました。

初期スクロース座標は、Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (化学識別子 PRD_900003) を通じてアクセスしました。立体構造の状況を調査するために、単一のスクロース分子を十二面体ボックスに配置し、TIP3P 水 81 と 0.15 M NaCl で溶媒和し、CHARMM36m 力場 82 を 3 回繰り返し、それぞれ 1 μs でシミュレーションしました。

これらのシミュレーションから得られたスクロースの立体配座は、Gromacs 解析スイート 84 に実装された gromos アルゴリズム 83 を使用して、クラスター化カットオフ値 4 Å でクラスター化されました。すべてのシミュレーションフレームの半分からなる最大のクラスターの中間構造が、代表的なショ糖ポーズとして採用されました。 SUC1 の中央空洞へのこのスクロースポーズの配置は、細菌ホモログメリビオースパーミアーゼ MelB (PDB: 4-ニトロフェニル α-d-ガラクトピラノシドと共結晶化された 7L17) によって知らされました 54。まず、MelB と SUC1 の構造は、次の位置に基づいて整列されました。次に、スクロースのグルコシル部分の環炭素が、MelB 構造に存在するガラクトースの環炭素と整列されました。SUC1 は、Asp152 の 2 つのプロトン化状態: Asp152(-) でモデル化され、負に帯電した側鎖が生じました。、および Asp152(H) (非荷電) 状態両方のシステムのシミュレーションは、この MelB にヒントを得た同一のショ糖ポーズで開始されました (拡張データ図 10a)。~14 μs のシミュレーション後、最も安定した結合を示したシミュレーション基質 (拡張データ図 10c)、Asp152(H) のリピート 2 を使用して、SUC1 の中央空洞における安定したスクロース結合ポーズを抽出しました。シミュレーション軌道は、タンパク質骨格の最初の Cα 原子に合わせられました。グロモスクラスタリングアルゴリズム 83 は、カットオフ値 3.8 Å でショ糖重原子の rmsd 値に使用され、最大クラスターの中間構造 (軌跡のフレームの 78% を表す) が安定したショ糖結合の立体配座として使用されました。 SUC1でポーズをとる。次に、同定された安定なショ糖ポーズから、Asp152 の 2 つのプロトン化条件下で、シミュレーションの第 2 ラウンドを開始しました (拡張データ図 10a)。

すべてのシミュレーションは、CHARMM36m 力場 82 および Gromacs 2020 シミュレーションソフトウェア 84 を使用して実行されました。最初に、力が収束するか最大値 500 kJ mol−1 nm−1 に達するまで、最急降下アルゴリズムを使用してシステムを最小化しました。シロイヌナズナの生育条件を反映するために、温度を 296 K に設定しました。温度は、平衡化段階では Berendsen サーモスタット 85 を使用し、製造実行中は速度再スケーリングサーモスタット 86 を使用して制御され、タンパク質と基質、膜、および溶媒の 3 つのグループに温度カップリングが適用されました。スクロースのみのシミュレーションの場合、結合したグループはスクロースと溶媒の 2 つだけでした。平衡化中は Berendsen バロスタット 85 を使用し、製造運転中は Parrinello-Rahman バロスタット 87 を使用して 1 atm の圧力を維持しました。膜を含むすべてのシミュレーションは半等方性の圧力結合タイプを持ちましたが、スクロースのみのシミュレーションは等方性の方法でシミュレーションされました。生産実行中、リープフロッグアルゴリズムの統合ステップは 2 fs に設定され、LINCS 制約アルゴリズム 88 はシステム内の水素原子に関連するすべての結合に適用されました。長距離静電相互作用の計算は、実空間相互作用のカットオフを 1.2 nm とした粒子メッシュ Ewald 法 89,90 を使用して実行されました。ファンデルワールス相互作用のカットオフ値は 1.2 nm に設定され、フォーススイッチ修飾子は 1.0 nm で適用されました。すべての系は、標準的な CHARMM-GUI プロトコルを使用し、主鎖原子とスクロース環原子については 4,000 kJ mol-1 nm-2 から開始して位置拘束を徐々に減少させて平衡化しました。タンパク質側鎖原子と残りのスクロース重原子については 2,000 kJ mol-1 nm-2。各脂質のリン原子、グリセロール部分の選択された二面角、および脂質テールの二重結合セグメントについては 1,000 kJ mol-1 nm-2。平衡化は正準アンサンブル (NVT) で 250 ps 実行され、その後 1.75 ns の等温-等圧アンサンブル (NPT) 平衡化が実行されました。膜内でのSUC1の生産実験は、位置制限を一切行わずに、5回または10回繰り返し、最大マイクロ秒のタイムスケールで実行されました（拡張データ図10c）。

タンパク質 Cα 原子の rmsd は、参照 SUC1 結晶構造に対して Gromacs84 で計算されました。ショ糖の rmsd 値を、基準として安定なショ糖ポーズと比較しました。スクロースポーズのrmsd値が3Å以下の場合、基質は結合しているとみなされるが、rmsd値がより高い場合、ポーズは非結合であるとみなされる。タンパク質とスクロースの相互作用は、ProLIF ソフトウェア 91 を使用して評価されました。このソフトウェアでは、水素結合は、3.5 Å の距離内で 130 ～ 180° の角度を形成する、水素を含むドナーとアクセプター間の相互作用として定義されます。疎水性相互作用は、4.5 Å 以下の距離に配置された非極性原子間に起こります。 Asp152(H) および Asp152(-) システムの平均接触マップは、安定したショ糖ポーズから開始するすべてのシミュレーションのフレームを考慮し、すべてのフレームにわたる各相互作用の頻度を計算し、少なくとも 25 時間にわたって発生した相互作用のみを視覚化することによって生成されました。合計シミュレーション時間の %。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

原子モデルと構造因子は、タンパク質データバンク (PDB: 8BB6) に寄託されました。 MD の初期スクロース位置の割り当てに使用される MelB 座標は、タンパク質データバンク (PDB:7L17) からダウンロードできます。この研究で使用したシロイヌナズナの SUC1 タンパク質配列は、UniProt (https://www.uniprot.org/) (UniProt: Q39232) で公開されています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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原稿に関するコメントをくださった D. Stokes 氏と U. Hammes 氏に感謝します。ダイヤモンド光源のビームライン I24 および I04、X 線データが収集された MAX IV 研究所のビームライン BioMAX、および結晶スクリーニング用の DESY-PETRA III に感謝します。 MD 計算は、オーフス科学計算センターのグレンデル S クラスターで実行されました。また、共焦点レーザー顕微鏡の指導をしていただいた M. Nadzieja (オーフス大学分子生物学遺伝学部植物分子生物学) にも感謝します。 MD 計算は、ノボノルディスク財団 (NNF18OC0032608 および NF20OC0065431) およびルンドベック財団 (R346-2020-1944) から BS への助成金によって可能になりました。このプロジェクトは、欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラム ( BPP への助成契約番号 101000936)

オーフス大学、分子生物学および遺伝学科、オーフス、デンマーク

ラウスト・バヴニョイ, ヤン・ハイナー・ドリラー & ビョルン・パニエラ・ペデルセン

オーフス大学化学科（オーフス、デンマーク）

ロレーナ・ズジック、アマンダ・ディルホルム・スタンゲ、ビルギット・ショット

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LB はサンプルの準備に貢献しました。 LB と BPP は構造データの収集と分析に貢献しました。 LB と JHD は活性アッセイに貢献しました。 LZ、ADS、BS は MD シミュレーションに貢献しました。

ビョルン・パニエラ・ペダーセンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Plants は、この研究の査読に貢献してくれた John Ward と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

A. thaliana SUC1 (アクセッション番号 Q39232)、SUC2 (アクセッション番号 Q39231)、SUC3 (アクセッション番号 O80605)、SUC4 (アクセッション番号 Q9FE59)、SUC5 (アクセッション番号 Q9C8X2)、SUC6 (アクセッション番号 Q6A329)、SUC7 (アクセッション番号 Q6A329) 間のアライメント番号Q67YF8）、SUC8（アクセッション番号Q9ZVK6）、SUC9（アクセッション番号Q9FG00）。保存された残基はグレースケールで強調表示され、黒は完全に保存されます。色付きのチューブは、N ドメイン (シアン)、EHR および IHR (灰色)、および C ドメイン (オレンジ) に見られる α ヘリックスを表します。重要な残基には、α-ヘリックスのマークの上に番号が付けられています。赤 (Asp152) と青 (Gln50) のプロトン供与体/受容体ペアを除いて、主要な残基は緑で強調表示されます。 EHR と M6 の間のジスルフィド架橋を形成するシステインは黄色で強調表示されます。 MFS スーパーファミリーを示す A モチーフは水色で強調表示されています。 N 末端 92 の翻訳後リン酸化部位は、明るいマゼンタ色に色付けされています。 SUC1におけるこの部位残基(Ser20)のアラニンへの変異は、野生型と比較して卵母細胞への取り込みに影響を与えなかった(拡張データ図7b)。

a、SUC1のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルおよび精製SUC1タンパク質の代表的なSDS-PAGEゲル。独立した実験が 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。 b、脂質立方相セットアップにおけるSUC1結晶の偏光写真と明視野写真。独立した実験が 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。 c、SUC1の非対称ユニットと結晶パッキング。 d, SUC1 の主鎖は、平均 47.10 Å2 の低/青 (29.91 Å2) から高/赤 (103.48 Å2) までの虹色の勾配を持つ原子変位因子 (B 因子) によって着色されています。

a、pH 5.5、1 mMスクロースの初期外部濃度でのSUC1発現卵母細胞(黒丸)および水を注入した卵母細胞(白丸)へのスクロースの取り込み。データポイントは平均±標準偏差です。 n = 4 卵母細胞。各卵母細胞は個別の測定値を表します。 b、卵母細胞取り込みアッセイは、実験設定の実行可能な範囲にわたって外部プロトン濃度に直線的に比例する古典的な pH 依存性を示します。輸送は、リン酸緩衝液中で pH 3.5 ～ 9.5 で測定されました。すべての測定は、1 mM スクロースの存在下で実行されました。バーは平均±標準偏差です。データポイントは個別の実験です (n = 4 (pH 3.5、4.5、5.5)、n = 5 (pH 8.5、9.5)、n = 6 (pH 6.5、7.5)。 c、SUC1 WT の SSM 電気生理学を使用したピーク電流示された対称 pH (pHin = pHout) で 10 mM スクロースの添加によって誘発されたプロテオリポソーム。バーは平均 ± SD および n = 4。点は個々の測定値。

ソースデータ

SUC1 の外側に開いた構造 (モノマー、鎖 A) の 1σ での重み付けされた 2mFo-DFc 密度。M1 から M12、EHR ヘリックス、C216-C220 ジスルフィド橋、IHR ヘリックス、および水を含む甘草として示される完全なモデルを含む最終モデル要素が重ね合わされています (赤い点）が含まれています。

a、分子表面として示され、濃いシアン色（最も親水性）から濃いアキノキリンソウ（最も親油性）まで着色された、分子親油性ポテンシャル（MLP）を有するSUC1構造の側面図。挿入図は、細胞膜小葉のらせん領域を強調表示しています。膜境界 (外側リーフレット; 青、内側リーフレット; 赤) は、PPM Web サーバー 93 を使用して計算されました。 b、両親媒性細胞内ヘリックス領域（IHR）は、パネルAと同様に親油性に従って色付けされたスティック（左）として標識された残基を含む漫画として示され、疎水性残基が細胞膜の内側リーフレットに面しているヘリックス領域の残基のエドマンドソンホイール投影図極性残基は細胞質に面しています (右)。 c、漫画として示された両親媒性細胞外ヘリックス領域（EHR）と、パネルAと同様に親油性に従って色分けされた棒として標識された残基（左）と、細胞膜の外側リーフレットに面した疎水性残基を有するヘリックス領域の残基のエドマンドソンホイール投影図極性残基はアポプラストに面しています。 d、IHRを標的としたSUC1変異体の卵母細胞取り込みアッセイ。取り込み活性は野生型の活性に対して正規化されています。対照は水を注入した卵母細胞である。バーは平均値 ± 標準偏差です。データポイントは個別の実験です (n = 6 (I272S/F273S、E271A、F276S)、n = 7 (L268S/F269S)、n = 11 (L268S/F269S/I272S/F273S/F276S)、n = 16(WT))。野生型と変異型間の差異の P 値は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定から得たものです (p = 0.9145 (L268S/F269S/I272S/F273S/F278S)、p = 0.2915 (I272S/F273S)、p = 0.8544 (F276S)、p = 0.6264 (E271A))。 e、EHRを標的とするSUC1変異体の卵母細胞取り込みアッセイ。取り込み活性は野生型の活性に対して正規化されています。対照は水を注入した卵母細胞である。バーは平均±標準偏差です。データポイントは個別の実験です（n = 3（L204S/M207S、F208S）、n = 6（L204A/M207A/F208A）、n = 7（C216A）、n = 16（WT））。野生型と変異型間の差異の P 値は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定から得たものです (p = 0.4290 (L204A/M207A/F208A))。

ソースデータ

ConSurf によって得られた、植物種全体の SUC 配列 (SUC1 に対して 35 ～ 95% の配列 ID を持つ) 間の SUC1 の残基の保存 (漫画で表示)。残基 (スティックとして表示) は、可変 (シアン) から完全に保存された (マゼンタ) まで色付けされます。

a、SUC1の外側に開いた結晶構造およびAlphaFold2で予測されたSUC1の内側に開いた状態における塩橋形成（黒色のフォント）または水素結合（灰色のフォント）に関与する標識残基を有する細胞外および細胞内の荷電残基。黄色のダッシュは水素結合を示します (chimeraX v1.4 のデフォルト設定で定義されている水素結合の距離と角度のカットオフ)。 b、構造内で観察された（細胞内ネットワーク）または予測された（予測された細胞外ネットワーク）水素結合および塩橋ネットワーク、ならびにSer20上のSUC1リン酸化部位（Pサイト）を標的とした、SUC1変異体の卵母細胞取り込みアッセイ。取り込み活性は野生型の活性に対して正規化されています。バーは平均値 ± 標準偏差です。データポイントは個別の実験です (n = 5 (D304N)、n = 6 (D123N、R139A)、n = 7 (H65K、D91N、R163K、D306N、E353Q)、n = 10 (S20A)、n = 13 (WT))。野生型と変異型間の差異の P 値は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定から得たものです (p = 0.1624 (S20A)、p = 0.9729 (H65K))。色は図 1e の残基の位置に対応します。 c、実験的に決定されたSUC1の外向きに開いた結晶構造（シアン）に重ねられたSUC1の内向きに開いたモデル（グレー）のAlphaFold2予測。黄色の破線は水素結合を示し、灰色の矢印は Gln50 との M1 ヘリックスの主な動きを示します (chimeraX v1.4 のデフォルト設定で定義されている水素結合の距離と角度のカットオフ)。

ソースデータ

a、pH 5.5での20倍（20 mM）CCCP（薄灰色）の添加なしまたは添加ありの卵母細胞取り込みアッセイ。水を注入した卵母細胞（タンパク質なし）を取り込みの対照として使用した。対照（スクロース摂取）とタンパク質なしおよびＣＣＰとの間の差のＰ値は、一元配置ＡＮＯＶＡ分析とそれに続くダネットの多重比較検定から得た。 P値を図に示します。バーは平均±標準偏差です。データポイントは個別の実験です (n = 4 (スクロース摂取)、n = 5 (CCCP)、n = 7 (タンパク質なし))。 b、示されている対称的なpH値でのSUC1プロテオリポソームに対するSSM電気生理学によって決定されたピーク電流。輸送は、非線形フィット解析を実行することにより、ミカエリス・メンテン動力学によって記述されました。灰色の円は、タンパク質が空のリポソームで調製されたセンサーからのピーク電流を示します。データポイントは平均±標準偏差（n = 3 の生物学的に独立した実験）です。

ソースデータ

SUC1 および C 末端 GFP を持つ対応する変異体は、アフリカツメガエル卵母細胞の原形質膜に対して同様の局在を示します。独立した実験が 2 回繰り返され、同様の結果が得られました。

a、MD解析のフローチャート。 b、すべての MD シミュレーションの過程における rmsd Cα バックボーントレース。すべての実験は結晶構造と比較されます。ｃ、プロトン化された（Ａｓｐ１５２（Ｈ））または脱プロトン化された（Ａｓｐ１５２（−））Ａｓｐ１５２を有する「ＭｅｌＢに触発された」開始姿勢のスクロースを用いて実行された初期シミュレーションからのスクロースのｒｍｓｄの時間経過の比較。 SUC1 へのスクロースの安定した結合は、濃い青色の背景で示されます。 d、同定された安定姿勢で開始してスクロースを使用して実行された5つのリピートすべてにおけるスクロース原子とSUC1残基の間の接触マップ。計算された原子間の接触は、ProLIF ソフトウェア91 によって提供される相互作用基準によって定義されます。フレームの少なくとも 25% で発生する相互作用のみが考慮され、水素結合相互作用 (青) と疎水性相互作用 (赤) が含まれます。 e、特定された安定した開始姿勢でスクロースを用いて実行されたシミュレーションからのスクロースのrmsdの時間経過の比較。Asp152の2つの異なるプロトン化状態、Asp152(H)およびAsp152を用いて、グルコシル部分を表す頭部を備えた針/ピンとしても示されている。 5 つの独立したリピートではそれぞれ (-)。 rmsd プロットの背景は、スクロースの結合位置 (濃青色) または非結合位置 (水色) を示しました。

補足表 1. データ収集と絞り込み統計。

取り込みアッセイ、1 分あたりの生カウント。 SSM 電気生理学、ピーク電流。

取り込みアッセイ、1 分あたりの生カウント。

取り込みアッセイ、1 分あたりの生カウント。 SSM 電気生理学、ピーク電流。

取り込みアッセイ、1 分あたりの生カウント。

取り込みアッセイ、1 分あたりの生カウント。 SSM 電気生理学、ピーク電流。

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転載と許可

Bavnhøj, L.、Driller, JH、Zuzzic, L. 他植物のスクローストランスポーターSUC1の構造とスクロース結合機構。ナット。植物 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41477-023-01421-0

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受信日: 2022 年 11 月 21 日

受理日: 2023 年 4 月 19 日

公開日: 2023 年 5 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01421-0

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自然植物 (2023)